发布时间：2020-04-21所属分类：农业论文浏览：1次
摘 要： 摘要：根据响应面法优化培养基配方，向基础培养基中添加廉价碳源和氮源，得到最优配方，即：蛋白胨7.5g/L，牛肉膏5.0g/L，葡萄糖(C6H12O6H2O)15.0g/L，淀粉8.78g/L，玉米秸秆水解液0.83L/L，氯化铵11.12g/L和豆粕粉11.81g/L，乙酸钠(CH3COONa3H2O)3.0g/L，磷
摘要：根据响应面法优化培养基配方，向基础培养基中添加廉价碳源和氮源，得到最优配方，即：蛋白胨7.5g/L，牛肉膏5.0g/L，葡萄糖(C6H12O6·H2O)15.0g/L，淀粉8.78g/L，玉米秸秆水解液0.83L/L，氯化铵11.12g/L和豆粕粉11.81g/L，乙酸钠(CH3COONa·3H2O)3.0g/L，磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)2.0g/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.58g/L，硫酸锰(MnSO4·H2O)0.25g/L。在最优培养基下，可得到凝结芽孢杆菌菌数(21.1±0.27)×108CFU/mL，高于基础培养基的14.8±0.31×108CFU/mL，增幅达到42.6%;芽孢率51.2%，高于基础培养基的43.2%，增幅达到18.5%。本实验数据为今后凝结芽孢杆菌工业化培养提供了参考依据。
关键词：凝结芽孢杆菌，正交，单因素，响应面分析，培养基优化
近年来，随着人们生活水平的不断提高，更多的消费者逐渐形成养生和自然生态的意识，拒绝食品添加剂、农药残留、劣质饲料添加剂，尤其是抗生素等对人和其它动物具有潜在危害的一类物质，这些物质的长期滥用，也导致了消费者对中国食品健康的焦虑和担忧。因此，研究工作者亟待寻找无害的替代者，而益生菌作为新兴的抗生素替代品，具有多方面的优势和潜力，得到国家政策的大力支持。凝结芽孢杆菌作为一种优质的益生菌，正在得到业内越来越多的关注。由于其兼具乳酸菌和芽孢菌共同的特点，以及良好的安全性，1989年就被美国FDA认可其为“普遍认为安全(GRAS)”的杆菌[1]。另外，兼性厌氧的特点可以使凝结芽孢杆菌在有氧及无氧的环境下均正常生长，能较好的适应低氧的肠道环境，更好的定制肠道，扩大有益菌的数量和质量。李国建等[2]研究表明，凝结芽孢杆菌制剂可显著提高育肥猪的平均日增重，降低饲料成本。吴建忠等[3]研究表明，连续3d灌服凝结芽孢杆菌制剂对乳猪黄白痢有很好的预防作用。付天玺等[4]研究表明，添加凝结芽孢杆菌均能显著提高奥尼罗非鱼胃肝胰脏和肠道蛋白酶活性。王彦波等[5]研究表明，凝结芽孢杆菌可以改善罗非鱼的生长性能和肌肉中钙、磷和粗脂肪的含量。ZHOU等[6]研究表明，饲用凝结芽孢杆菌可以提高广西黄鸡的饲料转化率并改善肉质。ALEX等[7]研究表明，凝结芽孢杆菌能提高肉用仔鸡的饲料转化率，调节肠道微生物的菌群平衡。
在市场需求的刺激下，凝结芽孢杆菌的产业化势在必行，而产业化面临的首要问题就是成本降控，其中一个重要因素就是培养基的调配和优化。本文将针对我司现有的基础发酵培养基进行针对性的优化，通过向其中增加廉价的碳源和氮源，在正交和单因素实验的基础上，锁定若干关键因子，并用响应面法分析得到最优配方，以期达到既能控制成本，又能培养出高密度菌体的目的。
1材料与方法
1.1菌种
凝结芽孢杆菌，来自我司实验室自主筛选，菌种保藏编号CCTCCNO：M2017836。
1.2培养基的配置
种子活化培养基(改性MRS)：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，酵母膏5.0g/L，葡萄糖(C6H12O6·H2O)20.0g/L，乙酸钠(CH3COONa·3H2O)5.0g/L，磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)2.0g/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.58g/L。
基础发酵培养基：蛋白胨7.50g/L，牛肉膏5.0g/L，葡萄糖(C6H12O6·H2O)15.0g/L，乙酸钠(CH3COONa·3H2O)3.0g/L，磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)2.0g/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.58g/L，硫酸锰(MnSO4·H2O)0.25g/L。
1.3主要试剂与仪器：
1.3.1试剂
蛋白胨，牛肉膏，酵母膏，均购自Oxiod公司，生化试剂级别;葡萄糖，柠檬酸氢二胺，乙酸钠，磷酸氢二钾，硫酸镁，硫酸锰，琼脂，硫酸铵，氯化铵，硝酸钠，硝酸钾，甘油等均购自国药集团化学试剂有限公司，分析纯;淀粉、蔗糖、玉米粉、豆粕粉均购自天津市致远化学试剂有限公司，分析纯;玉米水解液产自本公司。
1.3.2仪器
5L玻璃发酵罐，上海百伦;pH计，美国MettlerToledo;分析天平，广州天平仪器;摇床振荡培养箱，上海智城分析仪器;紫外分光光度计，真空干燥箱，平板计数器，均购自上海精密科学仪器;SCD-II高纯水装置，军事医学科学院卫生装备研究所;精准移液枪，Eppendorf。
1.4实验方法
1.4.1不同碳源的二水平正交实验本实验
主要针对葡萄糖作为碳源比对，备选碳源有玉米秸秆水解液(产自我司)，甘油，淀粉，蔗糖，玉米粉等五种碳源。
1.4.2不同氮源的二水平正交实验
以基础发酵培养基中氮源(蛋白胨)作为对比，备选氮源有酵母粉、豆粕粉、硫酸铵、氯化铵、硝酸钠和硝酸钾等六种。
1.4.3极差分析确定主次顺序
分别对五种碳源和六种氮源进行二水平正交试验，并采用极差分析处理数据，用结果导向判断所考察因素的主次顺序，并有选择的剔除次要因素，对主要因素进行响应面分析，达到优化配方的效果，此方法具有较高的真实度。
1.4.4单因素实验确定主要因素的水平
对正交实验确定的因素选取排名前三的主因素，分别进行单因素实验确定其因素水平。
1.4.5响应面实验及回归分析
利用软件Design-Expert设计实验，并对实验数据进行响应面分析，得到回归分析方程式，计算预测最优培养基的因素组成和最优菌体数[8-9]。
1.4.6摇瓶发酵验证最优培养基效果
斜面活化：从无菌低温甘油保菌管中挑取1-2环菌液，均匀波浪线涂抹在无菌斜面中，并在恒温生物培养箱中，37℃培养24h。
试管富集：从长满菌落的斜面上挑取1-2环固体菌落，接种于含有5mL种子培养基的试管中，置于恒温摇床，200r/min，37℃富集培养至菌体浓度OD600≈2。摇瓶发酵：用无菌移液枪吸取3mL富集菌液，接种于30mL的发酵最优培养基中，置于恒温摇床，200r/min，37℃，36h进行发酵验证试验。
2实验结果与分析
2.1不同碳源的正交实验设计与结果
根据前期初筛和文献搜索，锁定五个备选碳源，玉米秸秆水解液，甘油，淀粉，蔗糖，玉米粉，连同葡萄糖进行6因素2水平的正交试验。设计见表1。接种量为5%，置于37℃，200r/min的恒温摇床进行发酵，发酵时间为28h，以发酵结束时凝结芽孢杆菌的菌体数为因变量，做数据分析。发酵液的菌体数及极差分析见表2。
相关期刊推荐：《食品与发酵科技》创于1973年，是由国家新闻出版总署批准在国内外公开发行的关于食品和发酵的技术性刊物。主要刊载食品、酿酒、发酵、饮料、微生物、调味品、农产品保鲜与深加工等领域的科研论文、技术报告、科技成果、新产品、新技术及相关行业政策、产业导向和市场信息等。在全国同待业中享有权威，拥有一批稳定的读者群。
对数据进行极差分析可知，各因子对凝结芽孢杆菌的菌体数影响顺序为：淀粉>玉米秸秆水解液>葡萄糖>蔗糖>甘油>玉米粉。其中，葡萄糖是基础培养基中的碳源，作为对比，在后续考察中，不再讨论，且K2>K1，故将葡萄糖固定在水平2(10g/L)。除葡萄糖外，根据因子影响主次顺序(选取前三)，将淀粉，玉米秸秆水解液分别固定在各自的最优水平，即淀粉浓度12.5g/L，玉米秸秆水解液1L/L。
2.2不同氮源的正交实验设计与结果
根据前期初筛和文献搜索，锁定六个备选氮源，酵母粉、豆粕粉、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和硝酸钾，连同蛋白胨进行7因素2水平的正交试验。设计见表3。接种量为5%，置于37℃，200r/min的恒温摇床进行发酵，发酵时间为28h，以发酵结束时凝结芽孢杆菌的菌体数为因变量，做数据分析。发酵液的菌体数及极差分析见表4。
对数据进行极差分析可知，各因子对凝结芽孢杆菌的菌体数影响顺序为：氯化铵>豆粕粉=蛋白胨>酵母粉>硫酸铵=硝酸钾=硝酸铵。其中，蛋白胨是基础培养基中的氮源，作为对比，在后续考察中，不再讨论，且K2>K1，故将蛋白胨固定在水平2(7.5g/L)。除蛋白胨外，根据因子影响主次顺序(选取前三)，将氯化铵、豆粕粉、酵母粉分别固定在各自的最优水平，即氯化铵浓度14.5g/L，豆粕粉浓度15g/L，酵母粉浓度7.5g/L。考虑到酵母粉的成本较高，且其中含有色素、杂蛋白等杂质成分，在后期收集菌体中难以去除，故本实验将其排除在考察范围之外，只取氯化铵、豆粕粉作为考察对象。
根据上述实验结果，通过响应面分析法，重点考察淀粉、玉米秸秆水解液、氯化铵、豆粕四个影响因素。
2.3单因素实验确定四个主要因素的水平
对正交实验确定的4个主要影响因素淀粉、玉米秸秆水解液、氯化铵、豆粕粉分别进行单因素实验，确定因素水平，实验结果见图1。
由图1趋势可以看出，四个因素在不同浓度下，对凝结芽孢杆菌的菌体数产生了明显的影响，且基本成半“S”型曲线，即随着各自因素浓度的增加，菌体数均有不同程度的增加，但达到一定浓度后，其增加量对菌体数的影响很小。
其中，在基础发酵培养基中，单独额外添加淀粉后，菌体数随着淀粉浓度的增加而逐渐增多，当添加量达到13g/L时，菌体数达到最多，此后随添加浓度的增加，菌体数变化不大;单独额外添加玉米秸秆水解液后，菌体数随着玉米秸秆水解液浓度的增加而逐渐增多，当添加量达到1.1L/L时，菌体数达到最多，此后随添加浓度的增加，菌体数变化不大;单独额外添加氯化铵后，菌体数随着氯化铵浓度的增加而逐渐增多，当添加量达到14g/L时，菌体数达到最多，此后随添加浓度的增加，菌体数变化不大;单独额外添加豆粕粉后，菌体数随着豆粕粉浓度的增加而逐渐增多，当添加量达到16g/L时，菌体数达到最多，此后随添加浓度的增加，菌体数变化不大。
综上所述，淀粉的最适浓度区间在5-13g/L，玉米秸秆水解液的最适浓度区间在0.5-1.1L/L，氯化铵的最适浓度区间在8-14g/L，豆粕粉的最适浓度区间在7-16g/L。
2.4响应面分析
通过正交及单因素实验，分别选取淀粉、玉米秸秆水解液、氯化铵和豆粕粉4个影响因素为自变量，凝结芽孢杆菌的菌体数为响应值，运用BoxBenhnken中心组合设计原理，设计四因素三水平的响应面分析实验，得到29个试验点，具体见表5。通过摇瓶实验将对应组别的配方进行发酵实验，培养条件同2.1。最终检测发酵液中的菌体数，具体结果见表6。将所得实验数据用Design-Expert软件进行分析优化，回归模型及方差分析见表7。
采用Design-Expert软件进行数据分析，得到凝结芽孢杆菌菌数(Y)对淀粉(A)、玉米秸秆水解液(B)、氯化铵(C)和豆粕粉(D)的二次拟合回归方程，其中模型显著且失拟不显著，说明选取的四个因素对结果有正向显著影响[10];以凝结芽孢杆菌菌数(Y)为响应值，进行回归拟合后，四个因子对响应值的影响模型如下方程函数：
Y=-10.19754+1.21535A+20.79491B+1.56662C+1.33701D-0.27083AB-0.00625AC-0.02639AD-0.02778BC-0.2963BD-0.02037CD-0.03469A2-8.80556B2-0.05611C2-0.02679D2
根据实验结果，确定在基础发酵培养基中添加四种因子的最佳浓度分别为：淀粉8.783g/L，玉米秸秆水解液0.829L/L，氯化铵11.121g/L和豆粕粉11.811g/L，在此培养基下培养预测得到的凝结芽孢杆菌菌数可达到20.373×108CFU/mL。对以上四个因子两两间对响应值的影响进行响应面分析，结果见图2-图7。
2.5最优条件下的发酵验证试验
采用上述得到的最优发酵培养基，进行凝结芽孢杆菌的发酵培养，发酵条件如下：接种量为5%，置于37℃，200r/min的恒温摇床进行发酵，发酵时间为36h。得到的凝结芽孢杆菌数为(21.1±0.27)×108CFU/mL，与预测值Y=20.373×108CFU/mL基本吻合，说明回复方程具有真实性和可执行性，符合培养菌体的要求。具体结果见图8。
SCI SSCI AHCI