发布时间：2020-04-21所属分类：农业论文浏览：1次
摘 要： 摘要：为了对石油污染土壤进行更加有效的生物修复，应用统计分析软件SPSS分析石油污染土壤微生态环境构成要素间的典型相关性，优化提高微生物生长代谢的环境条件，并运用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术考察石油污染对土壤微生物群落结构及多样性的影响。结果表
摘要：为了对石油污染土壤进行更加有效的生物修复，应用统计分析软件SPSS分析石油污染土壤微生态环境构成要素间的典型相关性，优化提高微生物生长代谢的环境条件，并运用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术考察石油污染对土壤微生物群落结构及多样性的影响。结果表明，土壤中有效的氮、磷质量分数，含水率和石油污染程度是石油降解菌生长繁殖的限制因素，因此在生物修复过程中，投加适量的氮、磷营养，适当地提高土壤含水率会增加降解菌数量，可以提高石油污染土壤的修复效率;石油污染土壤中存在常见的石油烃降解菌;石油污染一定程度上使微生物种群趋于单一化和功能化，微生物种群多样性降低。通过上述研究可为调控和优化石油污染土壤的微生态环境以及识别优势群落提供客观可靠的技术依据。
关键词：石油污染土壤;微生态环境;SPSS;典型相关分析;变性梯度凝胶电泳(DGGE)
石油污染土壤微生态环境是指以微生物为主体的生物和非生物因子构成的复合系统，其主要特性是在微生物群落主导下的生物因子与非生物因子之间的相互作用与相互依存关系j。在土壤生态系统中，土壤中大量的微生物作为分解者几乎参与了土壤中的一切生物化学反应，它们将有毒的有机物分解或降解成为低毒或无毒的物质，是最活跃和具有决定性影响的组分之一，在石油污染土壤微生物修复过程中起着关键作用]。土壤受到石油污染以后，土壤的理化性质、微生物群落结构、物种多样性等将受到不同程度的影响。因此，在进行生物修复前，需要对土壤微生态环境开展必要的研究。
在石油污染土壤生物修复技术发展过程中，石油污染土壤的微生态环境研究受到广泛关注。张旭等[3]研究了温度对包气带土层中石油污染物生物降解的影响，发现温度是影响包气带土层中石油污染物自然衰减的重要因素;贾建丽等口探讨了油污土微生态环境的非生物因子与微生物活性的关系;刘五星等研究了石油污染对土壤理化性质和微生物群落结构及功能多样性的影响。但是，现有的研究存在试验样本量少、环境因素单一，以及仅考察单因素问的交互作用的问题，存在一定的局限性。
SPSS(Statisticalproductandservicesolutions)是发展较早、应用非常普遍的社会统计软件包，其典型相关分析(Canonicalcorrelationanalysis)是研究2组变量间相关关系的一种新型多元统计分析方法。它从2组变量中提取有代表性的2个综合变量，并利用2个综合变量之间的相关关系来反映两组指标之间的整体相关性，起到合理的简化变量的作用。其基本思想是，首先在每组变量中找出变量的线性组合，使其具有最大相关性;然后再在每组变量中找出第2对线性组合，使其与第一对线性组合不相关，而第二对本身具有最大相关性;如此继续下去，直到两组变量之间的相关性被提取完毕为止。这些综合变量被称为典型变量(Canonicalvariates)，第1对典型变量问的相关系数则被称为第一典型相关系数(一般来说，只需提取1～2对典型变量即可较为充分地概括样本信息)[。该方法在社会统计_5]、医疗卫生]、农林牧渔等方面均有广泛的应用，但在污染环境的治理，尤其是石油污染土壤生物修复方面的应用鲜见报道。
相关期刊推荐：《石油学报(石油加工)》(双月刊)1985年创刊，本刊主要刊登有关原油的性质与组成、石油加工和石油化工工艺、炼油化工催化剂、燃料和石油化学品及助剂、化学工程、反应动力学、系统工程、环保、油品分析等方面的基础理论和应用研究论文及研究结果的综合述评;优先报道这些方面的最新成果。
笔者通过对石油污染土壤调研取样，测定土壤的理化性质、石油烃含量和微生物数量等石油污染土壤微生态环境构成要素，运用SPSS软件对这些要素进行典型相关分析，得出影响微生物生长代谢的限制性因子，探讨提高微生物活性的机制，并采用PCR—DGGE技术研究石油污染土壤微生物群落结构，为生物修复技术的开发提供有力的理论依据。
l实验部分
1.1土样采集
从新疆克拉玛依油田风城油区及百口泉油区原油处理污泥池、事故池、钻井泥浆池及泄油池附近采集64份石油污染土壤。采用棋盘式五点采样法，取浅层(5～25cm)土壤，每点取样量大体一致，将各点取出的样品等质量混合，密封后置于冷冻保温箱中，运回实验室，于一2O℃保存分析土壤微生物群落结构，4℃保存分析土壤微生物数量，常温保存分析土壤理化性质。
1.2土样基本理化性质的测定
土样的基本理化性质包括pH值、含水率(质量分数)、有机质质量分数、有效氮质量分数、有效磷质量分数、有效钾质量分数，测定方法参照土壤农业化学分析方法]。
1.3土样含油率的测定采用超声一红外分光光度法测定
土壤含油率(质量分数)l1。
1.4土样微生物数量的测定
采用稀释平板法[11]测定土壤中细菌、真菌、放线菌数量。参照最大或然数(Mostprobablenumber，MPN)l】]测定土样中降油菌数量。
1.5土样微生物种群多样性分析
提取石油污染土壤微生物总DNAn。以细菌16SrDNAV3区的引物341F(5CGCCCGCCGC—GCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGC—CTACGGGAGGCAGCAG一3)和534R(5一ATTACCGCGGCTGCTGG一3)对提取的DNA进行PCR扩增。其反应条件为94℃预变性3min，94C变性1min，55℃退火lmin，72℃延伸lmin，30个循环，最后72。C延伸5min。以BIORADDcode系统对PCR产物进行DGGE分析口，聚丙烯酰胺胶质量分数为8，变性梯度为40～6O。电泳完毕后，将凝胶置于1mg/LEB的1×TAE缓冲液中染色，将染色后的凝胶用凝胶成像系统拍摄图像，并用图形分析软件QuantityOne对凝胶图像进行分析。将待测序条带切下，按前述PCR体系与条件进行扩增，送上海生工生物工程公司纯化测序，测序结果输入Genbank进行比对分析。
利用生态学的生物多样性指数香农一威纳指数(Shannon—Weiner，H)对DGGE条带所表示的微生物种群多样性进行表征口，判别污染土壤中的微生物多样性，H数值越大，种群多样性越高。其计算公式如式(1)所示。
2结果与讨论
2.1石油污染土壤基本性质分析结果
表1为石油污染土壤样品的基本性质及含油率。由表1可知，该地区土壤受到不同程度的石油污染，土壤含油率最高为1o.88，最低为3.13。土壤pH值分布于7.24～7.87之间，属于弱碱性土壤，这与当地特殊的地理、气候和水环境条件造成土壤盐分积累有关。有研究表明[2]，石油污染会使土壤H值降低，使碱性土壤更接近中性，更有利于土壤中微生物对石油的降解。当地的大陆性干旱气候导致土壤含水率低，在1.63～6.17之问。土壤有机质是指土壤中含碳的有机化合物m]，质量分数为(24.82~97.02)g/kg，一般来讲，其含量与土壤的肥力水平呈正相关，但受污土壤中的含油率对有机质含量贡献值较大，不能作为判断土壤肥力的指标。土壤中3大营养元素(氮、磷、钾)的有效含量很低，不利于微生物的生长繁殖。石油污染导致土壤中碳含量增加，氮、磷含量相对不足，远远低于微生物所需的氮：磷：钾的营养水平(120：10：1)E]。
2.2石油污染土壤微生物数量
石油污染土壤微生物数量测定结果列于表2。由表2可知，细菌的数量占优势，最高达2.3×10cfu/g;放线菌和真菌的数量相差不大，较细菌总数低1个数量级;降油菌数量较少，不到细菌总量的1/50。Forsyth等_】。研究表明，在土壤中内源性烃降解菌数量大于10cfu/g时，土壤中石油类污染物降解速率会较快。因此，对该地区石油污染土壤进行修复必须采取措施增加石油烃降解菌的数量。
2.3石油污染土壤基本性质与微生物数量之间的典型相关分析
应用统计分析软件SPSS中附带的典型相关程序命令对石油污染土壤基本性质(含油率xl，pH值x2，含水率x3，有机质含量x4，有效氮含量x5，有效磷含量z6，有效钾含量x7)与土壤微生物数量(细菌1，放线菌2，真菌3，降油菌y4)的关系进行分析，也就是选2个变量U和V(U为土壤基本性质典型变量，V为土壤微生物数量典型变量)来描述变量z和之间的关系。
由表3给出的石油污染土壤基本性质和微生物数量之间典型相关系数与维度递减检验可以看出，第1对典型变量U1和V1的典型相关系数为0.981，第2对典型变量U2和V2的典型相关系数为0.638，2对典型变量的显著性检验P<0.05，表明相关显著;第3、4对典型变量的典型相关系数显著性检验P>0.05不具统计学意义，本研究中不予考虑。综上所述，石油污染土壤基本性质和微生物数量之间的相关关系可以由第1、2对典型变量来描述。
由表4第1典型变量可知，石油污染土壤基本性质第1典型变量U1中起主要作用的是z5和-z6，即有效氮含量、有效磷含量;微生物数量第1典型变量V1中起主要作用的是4，即降油菌数量。由此可得出结论，石油污染土壤的有效氮含量和有效磷含量与降油菌数量关系最大。由土壤基本性质测定可知，土壤中有效氮和有效磷含量很低，营养成分是石油降解菌生长繁殖的主要限制因素l_1]。因此在生物修复过程中，投加适量的氮磷营养会增加降解菌数量，提高石油污染土壤的修复效率。
由表4第2典型变量可知，石油污染土壤基本性质第2典型变量U2中起主要作用的是z1、z3，即含油率、含水率;微生物数量第2典型变量V2中起主要作用的是3，1、4，即细菌数量、降油菌数量。由此可知，石油污染土壤的含油率和含水率与细菌总数和降油菌数量关系最大，并且土壤含油率与细菌和降油菌数量呈负相关关系。研究表明E192O]，一定量的石油烃丰富了土壤中的碳源，刺激微生物的生长，同时在污染物的诱导下会产生微生物的种类选择和优势菌的富集，但当污染物含量超过一定范围时，又会产生毒性而抑制微生物的活性。所采集样品的地区的土壤含油率最高达10.88，对其中细菌和降油菌的生长产生了强烈的抑制作用。当地的气候环境导致土壤的含水率较低，并且石油的强疏水性导致高含油率土壤的疏水性增加，使土壤储水能力下降，含水率进一步降低¨，更加抑制细菌和降油菌的生长。因此在生物修复过程中，适当提高土壤的含水率有助于提高修复效果。
2.4石油污染土壤微生物群落多样性分析
从石油污染土壤样品中选取含油率大于6且石油降解菌数量较大的3份土壤样品(A1、A2、A3)与含油率小于6且石油降解菌数量较大的3份土壤样品(B1、B2、B3)进行DGGE分析，结果如图1所示。
根据DGGE对DNA的分离原理，谱带上的不同条带代表该样品中不同细菌16SrDNAV3区基因片段_2，条带信息可初步反映污染土壤的微生态环境与微生物种群多样性的相互关联性l2。由图1可知，6份石油污染土壤样品经DGGE分离得到28个较为明晰的条带，其中含油率大于6的土样A1、A2、A3条带数目较少，分别为14、10、9;含油率小于6的土样B1、B2、B3条带数目相对较多，分别为23、18、15。
以H值对各石油污染土样DGGE图谱所表现的微生物种群多样性进行分析，结果见表5。
由表5可知，石油污染土壤样品的H值在2.05～2.90之间，其中含油率大于6的土壤样品H值均低于2.50，而含油率小于6的土壤样品H值均大于2.50，说明石油污染物对微生物有抑制作用，一定程度上使微生物种群趋于单一化和功能化，微生物种群多样性降低。
SCI SSCI AHCI