乳酸菌发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果

发布时间：2020-04-18所属分类：农业论文浏览：1次

摘 要： 摘要:乳酸菌代谢过程中产生的抑菌物质乳酸菌素具有高效、无毒、无副作用、对环境无污染等优点，可有效抑制或杀死食品中产生的病原菌和腐败菌，是一种天然防腐剂。金黄色葡萄球菌是食源性疾病的病原体之一，由其引起的食物中毒已成为世界性的公共问题。本文中

　　摘要:乳酸菌代谢过程中产生的抑菌物质乳酸菌素具有高效、无毒、无副作用、对环境无污染等优点，可有效抑制或杀死食品中产生的病原菌和腐败菌，是一种天然防腐剂。金黄色葡萄球菌是食源性疾病的病原体之一，由其引起的食物中毒已成为世界性的公共问题。本文中，笔者以从发酵食品中分离的7株乳酸菌为研究对象，研究其对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，抑菌实验采用琼脂扩散法。结果表明:其中4株乳酸菌抑菌效果较好，最佳培养条件为37℃、静置培养48h。在一定浓度范围内，抑菌效果随发酵液用量的增加而增大。所产乳酸菌素热稳定性较强，且能在较宽的初始发酵pH范围内保持活性。此研究结果为乳酸菌素的开发提供了一定的理论基础。

　　关键词:乳酸菌;乳酸菌素;抑菌效果;金黄色葡萄球菌;食物中毒

　　乳酸菌是能发酵糖类、主要代谢产物为乳酸的一类革兰氏阳性菌，广泛存在于各类食品中。乳酸菌在生长发酵过程中能产生抗菌物质，利用这一特点，乳酸菌在一定程度上能起到食品保鲜功能[1]。乳酸菌代谢过程中产生的抑菌物质———乳酸菌素，是起抑菌作用的最重要活性物质[2]。，是乳酸菌代谢过程中合成并分泌到环境中的一类对同种或亲缘关系较近的菌株有抑制作用的杀菌蛋白或多肽物质，具有高效、无毒、无副作用、对环境无污染等优点，可有效抑制或杀死食品中产生的病原菌和腐败菌[3-7]。同时，乳酸菌素易被人体消化道的部分蛋白酶分解，且不会在人体内蓄积而引起不良反应，因此被认为是一种具有广阔应用前景的天然食品防腐剂、饲料添加剂和新的抑菌药物。因此乳酸菌素将在人类疾病防治、动物医药保健及食品防腐等方面体现巨大的应用潜力[8-9]。近年来国内外许多学者研究发现乳酸菌细菌素不仅能抑制近源菌株的生长，还可抑制其他菌株的生长[10-11]。

　　金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是兼性厌氧的革兰氏阳性菌，是医疗感染和食品中最常见的病原体之一，由其引起的食物中毒已成为世界性的公共卫生问题[12]。本研究中，笔者从发酵食品中分离7株乳酸菌，研究其对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，以期为金黄色葡萄球菌的防制提供一定的科学依据。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　从发酵食品中分离的乳酸菌的乳酸菌株A、B、a、b、c、d及e，保藏于青岛农业大学发酵工程实验室。

　　金黄色葡萄球菌，购于中国普通微生物菌种保藏中心，编号为1.8721。

　　MRS肉汤及MRS固体培养基、营养琼脂及营养肉汤，青岛海博生物技术有限公司。

　　NaCl、盐酸、NaOH、乳酸等(分析纯)，天津市北方天医化学试剂厂。

　　1.2方法

　　1.2.1指示菌的活化

　　挑取在斜面培养基上保存的金黄色葡萄球菌菌苔分别接种于营养琼脂培养基的斜面上，在37℃的恒温箱中培养24h，然后在4℃条件下保存菌种，备用。

　　1.2.2具有金黄色葡萄球菌抑菌活性的乳酸菌的筛选

　　1)乳酸菌种子液及发酵上清液的制备

　　挑取斜面培养基上的乳酸菌菌苔接种到10mLMRS液体培养基中，于37℃静置培养24h，作为种子液，备用。取种子液0.5mL接种于50mLMRS液体培养基中，振荡均匀，在37℃恒温培养箱中静置培养48h后，在4℃条件下10000r/min离心10min，取上清液备用。

　　2)乳酸菌对指示菌的抑菌实验

　　挑取1环活化保存的指示菌，接种于装有生理盐水的试管中，振荡均匀，在凝固冷却的营养琼脂平板中央滴加0.1mL金黄色葡萄球菌的菌悬液，用涂布棒涂布均匀，静置30min。用灭过菌的内径为12mm的打孔器在涂布后的培养基上打孔，每个平板需等距离地打3个孔。分别取0.15mL乳酸菌发酵液接入打出的小孔中，将平板放于37℃恒温培养箱中培养24h。观察抑菌效果，测量并记录抑菌圈的直径大小。

　　3)乳酸对抑菌效果的影响

　　将乳酸标准液分别接入不同的MRS液体培养基中，调节pH与每株乳酸菌发酵上清液的pH相同，分别进行抑菌实验。37℃培养24h后，观察实验结果，测量并记录每株乳酸菌发酵上清液及乳酸标准液的抑菌圈直径大小。

　　4)乳酸菌发酵液对抑菌效果的影响

　　分别取2、4、6、8和10mL乳酸菌发酵上清液加入到98、96、94、92和90mL的MRS液体培养基中，配成2%、4%、6%、8%和10%的乳酸菌发酵上清液液，进行抑菌效果的实验。37℃培养24h后，观察实验结果，测量并记录每株乳酸菌不同浓度菌液的抑菌圈直径大小。

　　5)初始pH对乳酸菌抑菌效果的影响

　　用1mol/L的盐酸和NaOH溶液将MRS液体培养基的pH分别调节至4、5、6、7和8，分别取0.5mL种子液接入调好pH的50mLMRS液体培养基中，放于37℃恒温培养箱中培养48h，进行抑菌效果的实验。37℃培养24h后，观察实验结果，测量并记录每株乳酸菌不同pH条件下的抑菌圈直径大小。

　　6)发酵时间对乳酸菌抑菌效果的影响

　　取种子液0.5mL接入50mLMRS液体培养基中，分别取培养时间为12、24、48和72h的乳酸菌上清液进行抑菌效果的实验。37℃培养24h后，观察实验结果，测量并记录每株乳酸菌不同发酵时间的抑菌圈直径大小。

　　7)处理温度对乳酸菌抑菌效果的影响

　　将乳酸菌发酵上清液放在60、80和100℃的条件下处理30min，进行抑菌效果的实验。37℃培养24h后，观察实验结果，测量并记录每株乳酸菌不同温度条件下的抑菌圈直径大小。

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　　2结果与讨论

　　2.1乳酸菌抑菌效果的初步测定

　　利用笔者所在实验室分离保存的7株乳酸菌分别对金黄色葡萄球菌进行抑菌实验，结果如表1所示。

　　由表1可知，这7株菌对金黄色葡萄球菌都有一定的抑菌效果。其中，菌株B的抑菌效果最好，菌株a的抑菌效果最差。菌株A、B、b和e对金黄色葡萄球菌的抑菌效果明显优于其他几种指示菌。因此，后续实验采用抑菌效果较好的菌株A、B、b和e进一步研究。荣凤君[13]从4种发酵食品中筛选出了11株具有抑菌作用的乳酸菌，其中有4株对金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌效果;胡彦新等[14]从传统发酵肉制品中分离出了63株乳酸菌，其中有2株对金黄色葡萄球菌有较明显的抑制能力。

　　2.2乳酸菌发酵液对金黄色葡萄球菌抑制效果

　　2.2.1乳酸对抑菌效果的影响

　　考察4株乳酸菌发酵液及乳酸标准溶液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，结果如图1所示。

　　由图1可以看出:乳酸溶液对金黄色葡萄球菌有一定的抑菌效果，但是4株乳酸菌的抑菌效果显著大于纯乳酸的抑菌效果(P<0.05)，说明在乳酸菌发酵液中，除了乳酸外，还存在其他的抑菌物质，推测为乳酸菌素。郗恩光等[15]通过调节发酵上清液的pH来消除乳酸对抑菌效果的影响，而本研究是通过纯品的乳酸作为对照来排除其影响。

　　2.2.2乳酸菌发酵液用量对抑菌效果的影响

　　考察4株乳酸菌发酵液体积分数对金黄色葡萄球菌抑菌效果的影响，结果如图2所示。

　　由图2可看出:在一定体积分数范围内，随着乳酸菌发酵液用量的增大，抑菌效果呈逐渐增强的趋势，在设置的5个梯度中，菌株b在的发酵液体积分数为6%时，抑菌效果达到最大值，而菌株A、B和e的发酵液的体积分数为10%时的抑菌效果最佳。

　　由此可看出，菌株b的发酵液在低浓度时即能达到较好的抑菌效果，随着浓度的继续增大，抑菌效果基本不发生变化。

　　2.2.3初始pH对抑菌效果的影响

　　考察不同初始pH条件下，4株乳酸菌发酵液对金黄色葡萄球菌的抑制效果，结果如图3所示。

　　由图3可知:在初始pH为6左右时培养的4株菌，它们的发酵液抑菌效果最好;在pH<6的情况下，每株菌的抑菌效果随着pH的增大而增强;在pH>6的情况下，抑菌效果随着pH的增大而减弱。这可能是这4株乳酸菌在pH为6左右生长最好，产生了大量的乳酸及具有抑菌能力的生物活性物质。其中，初始pH在3～7时，菌株e的生长不受影响，而且它的发酵液有较好的抑菌效果，说明该菌株对初始pH的要求比较宽泛。

　　2.2.4发酵时间对抑菌效果的影响

　　考察不同发酵时间对4株乳酸菌的发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，结果如图4所示。

　　由图4可看出:4株菌株在24h后抑菌效果趋于稳定，随着培养时间的延长，抑菌效果增强缓慢，它们在发酵48h时的发酵液，对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，并且培养时间超过48h后，随着培养时间的延长，抑菌效果基本不变。这说明，发酵液在不同的发酵时间，会产生不同的抑菌效果，培养时间48h，这4株菌的发酵液中抑菌活性物质的抑菌效果即可达到最好。赵艺竹等[16]的研究表明，随着发酵时间延长，乳酸片球菌LAB12发酵上清液抑菌作用增强，22h时抑菌效果达到最大且趋于稳定;而植物乳杆菌LAB19在发酵约10h后，抑菌效果基本保持不变。因此，发酵时间对抑菌效果有较大的影响。

　　2.2.5处理温度对乳酸菌发酵液抑菌效果的影响

　　考察不同温度条件下处理后的4株乳酸菌的发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，结果如图5所示。

　　由图5可知:5株乳酸菌发酵液在60和80℃处理30min后，仍然具有较好的抑菌效果，且60℃处理后的抑菌效果要优于80℃处理后的抑菌效果。在100℃处理30min后，失去抑菌效果，说明100℃高温处理会使乳酸菌素遭到破坏，在80℃以下这4株乳酸菌的抑菌效果较稳定，即在巴氏杀菌的温度范围内稳定性较好，有潜力应用于食品中。

　　3结论

　　以从发酵食品中分离的7株乳酸菌为对象，研究其对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，结果表明，菌株A、B、b及e的抑菌效果较好。通过乳酸实验表明，发酵液中含有除乳酸之外的抑菌成分，最佳发酵条培养时间为37℃、静置培养48h。在一定浓度范围内，随着乳酸菌发酵液浓度的增大，抑菌效果呈逐渐增强的趋势。4株菌能在较宽的初始发酵pH范围内保持活性，且具有较好的温度稳定性。因此，这4株乳酸菌的发酵产物对金黄色葡萄球菌有良好的抑菌作用，可进一步对其中的生物活性物质进行分离纯化，为抑制金黄色葡萄球菌天然防腐剂开发与利用提供一定的研究基础。