发布时间：2019-11-01所属分类：医学论文浏览：1次
摘 要： [摘要] 在全球范围内, 因终末期器官衰竭而需要器官移植的患者人数不断增加, 但从已故或活体捐赠者获得的器官数量非常有限。因此, 利用猪器官/组织进行异种移植是解决器官供给短缺的最终办法之一。尽管异种器官移植的研究取得了很大进展, 然而, 要真正走向临
[摘要] 在全球范围内, 因终末期器官衰竭而需要器官移植的患者人数不断增加, 但从已故或活体捐赠者获得的器官数量非常有限。因此, 利用猪器官/组织进行异种移植是解决器官供给短缺的最终办法之一。尽管异种器官移植的研究取得了很大进展, 然而, 要真正走向临床仍然存在许多障碍, 特别是免疫排斥问题。随着该领域研究的不断深入, 特别是各种基因编辑技术的发展, 实现对猪产生超急性排斥的基因敲除及猪的多种基因进行人源化改造，再在非人类灵长类动物移植模型中进行安全性及功能性评估，移植器官的存活率显著提高。利用CRISPR/Cas9技术将猪内源性逆转录病毒 (PERV)从猪基因组中去除, 避免了异种器官移植后内源性病原体感染宿主的潜在风险, 具有里程碑意义。本文对异种移植研究需要跨越的障碍、进展、安全、监管和现状等进行了综述。
[关键词] 异种移植; 免疫排斥; 猪内源性逆转录病毒(PERV); CRISPR/Cas9
放眼世界，因患器官衰竭等终末期疾病而等待移植的患者数量不断增加。然而, 通过捐赠获得的供体器官的数量非常有限。据不完全统计，全世界大概有 200万人需要器官移植，但是器官捐献的数量远远低于需要的人数。移植器官供体不足这个问题，在医疗科技高速发展的今天，随着老龄化和慢性疾病的多发而愈发严重。这个问题在没有器官捐献传统的国家像中国更是一个严重的医疗问题和社会问题。中国是移植器官紧缺的大国。 据不完全统计，我国器官衰竭患者每年达到 100 万，患者人群随着人群老龄化逐年递增。如果有合适的器官供体，这些患者的生活可以得到很大的改善甚至生命得以挽救。2015 年 1 月 1 日起，我国全面停止使用死囚器官作为移植供体来源，公民逝世后自愿器官捐献成为器官移植使用的唯一渠道，此举消除了国际上对我国器官移植供体获取的争议。但是因为我国受儒家文化“身体发肤，受之父母” 影响，器官捐献数量很难上升。每年器官捐赠人数约 8 000，这相当于每 100个需要器官移植的患者人群里，只有一个患者可以有供体器官，其他的患者都在漫长的等待中失去了生命。为了缓解这一问题，出现了各种替代方案。这些方案包括干细胞技术、组织工程、囊胚互补、医疗设备更新和异种移植等[1,2]。近年来，由于猪与人的各器官大小及生理相似且无太多的伦理争论，异种器官的移植研究集中在对猪的基因改造，然后再进行猪到非人类灵长类动物(NHP)的临床前和临床异种移植研究，使猪到人的异种器官移植变得非常有希望。
1 异种器官移植历史和障碍
将动物器官和细胞用于人体临床移植的记录包括:1905年的兔肾和肝脏; 20世纪20年代和30年代的非人灵长类动物(NHP)脏器[3]; 从20世纪60年代到 9 0 年代，使用 NHP 的肾脏、心脏和肝脏给人体移植试验均未能实现移植物存活时间的延长。此后，异种移植的重点转向了以猪作为器官潜在的供体[4,5]。随后几十年，在猪 -NHP 的异种移植研究中，发现了几种不同的免疫障碍，即: 超急性排斥反应(HAR)、急性血管排斥反应(AVR)和迟发性移植排斥反应(DXR)。在几分钟到几个小时内发生的 HAR 是第一个需要克服的障碍。只在猪体内表达但不在人类及 NHP 体内表达的 aGal 抗原的发现对于解决异种移植中HAR问题是一项重大的突破[6, 7]。人类及 NHP 在与病原体的斗争中，体内天然存在 aGal 抗体，可以与猪脏器的血管内皮细胞结合并诱发补体介导的脏器损伤。
随着对异种器官移植认识的不断深入, 解决异种移植从基础到临床需要解决以下几个问题: ①物种间先天免疫不相容; ②凝血问题; ③跨物种感染。为解决免疫不相容问题，通过寻找受体的先天及后天免疫靶点，通过理化乃至生物的手段靶向调节受体免疫; 此外，通过对供体的改造(主要是基因水平)，使其逃脱受体免疫系统的监视，达到减少排斥的目的; 为解决凝血问题，除降低受体的凝血级联反应，调控受体凝血系统和纤溶系统平衡，还将在基因水平上对供体进行改造[8,9]。
2 异种器官移植的安全问题
任何新的药物或治疗方法等，其安全性是第一位的。安全/有效性是研究和开发中的一个关键问题。不仅包括异种细胞、组织或实体器官使用的安全性，还包括用于防止排斥反应的免疫抑制方案的安全性。
对于以猪为供体的异种移植来说，猪器官的安全性是首要问题。猪携带的传染性病原体存在于异种移植物中，可能会感染受体并导致疾病。异种移植物的细胞是活细胞，意味着其不能像非细胞材料那样消毒。这就促使动物需要在指定的、无特定病原体的专门设施中饲养。其脏器获取，也必须严格遵循无菌原则。除不能含有影响群体健康状况的感染性病原体外，也不应含有可能跨物种传播的病原体，细菌如沙门氏菌、放线菌; 病毒如巨细胞病毒、EB病毒(epstein-barr virus)、戊型乙肝病毒等; 寄生虫如弓形虫都是人畜共患病。这些病原体是外源性的，因此可以通过特定的方法从猪群体中清除[10]。
根据世界卫生组织(WHO)的要求，要排除感染免疫抑制猪的外源性细菌有 24 种，外源性病毒 1 7 种，外源性寄生虫有 8 种，外源性霉菌 6 种。其中如猪瘟、猪伪狂犬病、猪链球菌病、猪口蹄疫、猪副嗜血杆菌病、猪传染性胸膜肺炎、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病、猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒，猪细小病毒感染、猪大肠杆菌病、猪痢疾、仔猪副伤寒、猪气喘病、猪肺疫、猪传染性萎缩性鼻炎等对猪的生长繁殖健康带来极大困扰等。但目前在临床上以混合感染的形式出现的较多，如猪瘟+猪繁殖与呼吸综合征; 猪瘟+猪肺疫; 猪瘟+猪链球菌; 猪瘟+ 猪附红细胞体; 猪链球菌+猪副嗜血杆菌; 猪圆环病毒+猪附红细胞体; 猪链球菌+猪附红细胞体等，不仅对猪的生长繁殖健康带来极大困扰，而且会引起猪的死亡，更不用说用来做器官移植了。异种器官的移植的临床试验通常是在抑制受体动物的免疫系统的条件下进行, 从猪器官移植到患者，也需对患者使用免疫抑制剂以降低受体对移植器官的免疫排斥。在这样的状况下，动物携带的病原微生物，很容易感染动物，呈现临床症状。动物的疾病和隐性感染会造成非研究方案因素的差异，从而降低动物的研究价值，同时也增加了动物的浪费，降低动物福利，也会对实验人员造成潜在的健康风险，增加科研成本，浪费科研时间。应按国际规划及专业实践，建立符合 WHO 的无指定病原体 (DPF)的猪场，建立一个预防医学计划，保证动物的生物安全，提高动物的健康，以确保高质量的动物运用于异种器官的移植实验。
内源性病毒的情况则有所不同。内源性逆转录病毒(PERV)可以在体外从猪传播到人体细胞的发现引发了激烈的讨论[11,12]。尽管有研究[13,14]表明，猪到人跨物种传播的风险是相当低的和可控的。据报道，在对大量直接接触活猪组织的人群进行的长期研究随访中，未观察到猪向人类传播病毒。尽管如此，直到 2015 年，PERV 仍是异种器官移植安全道路上不可逾越的障碍。杨璐菡等[15,16] 使用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除猪原代细胞系中的所有 PERVs 拷贝，并于 2017 年通过克隆技术产生了 PERV 敲除的无 PERV 的猪，为解决临床异种器官移植中的安全问题铺平了道路。
3 异种器官移植的进展
目前异种移植已经进入了重要的历史转折期。使用 GalT-KO、CD55 转基因猪做为供体，同时应用 CD4、CD8 抗体及共刺激因子抑制剂 anti-CD154 或belatacept(贝拉希普)的情况下, 肾脏异种移植的存活时间达到了 499 d，超过了历史上 NHP 到人肾脏移植存活 9 个月的记录[17]; GalT-KO、人补体调节蛋白 CD46、hTBM 转基因猪到狒狒的异位心脏移植的移植物存活时间长达945 d, 其免疫抑制方案包括 CD20 及 CD40 抗体, 同时给予吗替麦考酚酯[18]。尽管心脏异位辅助移植的存活时间很长, 但原位异种移植却很短, 只有57 d[19]。David Cooper认为原位移植结果困难的原因很多, 主要可能原因为心脏对于缺血和其他损伤非常敏感。但原位移植仍然是心脏移植向临床转化的必经之路[20]; 近期，美国麻省总院的团队将猪-NHP异种肝移植的存活时间由8 d延长至29 d, 有赖于GalT-KO猪供体的使用及CD40抗体、贝拉希普及术后人凝血因子复合物的给予[21]; 此外，猪肺脏-NHP异种移植物存活只有10 d[22]; 胰岛异种移植的移植存活时间已经接近1 000 d [23], 胰岛移植属于细胞移植的范畴, 有广泛的应用前景。总的来说，基因编辑技术与免疫抑制剂及异种移植技术的结合，使异种器官移植领域得到了极大的发展，而异种器官移植的发展，也促进基因编辑技术更加成熟，拓宽了其应用范围，二者相互促进，将共同为人类的健康造福。
4 异种器官移植的监管
2004年, WHO敦促会员国在适当的监管监督下并在特定的医疗机构内进行异种器官移植实验; 随后, WHO于2008年举行了第一次关于异种器官移植临床试验监管要求的全球会议，并且在此后进行的会议中，对于异种胰岛移植、异种角膜移植等发表了全球共识和声明。全球范围内该领域的代表在异种器官移植的临床应用方面的进展进行了讨论。
事实上, 1990年代末监管机构便提出了对于异种病原体交叉感染的担忧。1997 年 10 月, 美国食品和药物管理总局(FDA)暂停了正在进行的使用猪制品的相关试验, 直到PERV检测方法的成功建立和实施[24]。此后, 许多国家建立了异种器官移植的临床使用指南或法规。这些条例和准则既针对猪的捐赠者，也针对人类的接受者。例如, 关于作为器官供体的猪，美国的指导方案中指出: 供体猪需要在 “生物安全”的隔离设施中饲养, 维持封闭种群处于无特定病原体状态至少两代; 关于人类受体, 监管文件既涉及个体, 也涉及公共卫生方面, 包括PERV 传播的评估, 以及“未知”病原体的评估[25]。同时, 为了进行回顾性分析, 需要定期取样并归档来自供体猪和人类受体的组织和细胞。欧盟和美国持续定期取样的时间跨越分别是 30 年及 50 年。
我国《人体器官移植条例》是为规范人体器官移植，保证医疗质量，保障人体健康，维护公民的合法权益制定。于 2007 年施行，其中暂没有涉及异种器官移植相关的规定。因此，我国异种器官移植领域的相关法律、法规仍有待完善。
5 中国在异种器官移植中有利条件
中国由于得天独厚的丰富的动物资源，特别是非人灵长类动物与小型猪，又有杨璐菡团队带回的国际首创的清除 PERV 及降低免疫排斥的基因编辑技术，我们有极大可能在不久将来，实现异种器官移植方面在国际上弯道超车，获得率先突破，占领国际异种器官移植的制高点，实现由临床前转化到临床试验的成功，从而给数百万患者带来福音。国家鼓励创新、创业的环境，特别是“大众创业，万众创新”等理念的提出，对很多在海外求学和工作的科技工作者产生了深刻影响，许多在海外训练有素的科学家在这种良好环境下回国，希望能将在国内外所累积的专业知识、研发理念以及多年在跨国制药企业的新药研发经验，在中国发展创新开发平台上，与国内研究机构一起，探索出具有国际领先水平的异种器官移植的方法。通过国内同仁共同努力，可以加速推进研发项目进入临床，并快速建立具有全球市场竞争力的异种器官移植的方法及产品，特别是胰岛移植，并积极扩展国际合作，进军国际市场，使中国走在异种器官移植的前沿。
异种器官移植可以解决巨大医疗问题并且有巨大的经济价值。异种器官移植的成功会解决国家每年百万患者的器官缺失问题, 对于人群老龄化, 慢性病衍生, 缺乏器官供体的社会医疗现实, 提供了革命性的解决方案。全球异种器官移植, 仅器官供给就有>1 500亿美元的市场经济效益，另外因器官移植而带动的相关产业的市场经济效益更不可估量。
异种器官移植可以解决社会问题。占领国际异种器官移植制高点，有力回应人权问题。中国移植器官供体不足，不仅是国家医疗问题，也是社会问题，由于 2015 年之前对器官供体的来源监管问题，国际医疗界和人权组织上对中国移植进行了长达 20 年的攻击。中国政府科学性扶持替代器官供体研发和监管，体现了大国对人民负责，用最新科技来解决社会问题的态度和能力。
异种器官移植具有国家战略影响。异种器官移植是基因编辑和再生医学最先进的应用，其成功研发会带动国家整体基因和再生医学及制药领域产业化和国家监管体系的发展。一个技术的革命必将带来生产力的革命，改变我们的生活和思考方式。自 2013 年，CRISPR-Cas9 基因工具问世，很多应用和研究已经在国内外展开。为抢占制高点，国内许多研究机构包括启函生物建立了具有创新性、前瞻性、产业化并成的集约化的基因修改和再生医学医药公司。基因修改工具还很新兴，有很多未知的问题，需要严谨和创新的科研团队、支持工具合理的使用和长期的研发。基因修改技术作为一个平台技术，需要社会和产业的需求相结合，才能真正把科研成果转化成为为社会服务的现实生产力。在产业化推广上，需具有国际产业视野也需了解和结合中国国情，找到新成果转换成生产力的途径与突破口。
6 结论和展望
经过20多年的探索,异种器官移植领域取得了巨大的进步并且积累了大量的知识, 这些知识涉及从生物医学到商业产品开发等多个领域。猪心脏、肾脏和胰岛等到NHP的异种移植存活时间逐步延长并且功能良好。伴随着基因工程技术的快速发展、新型免疫抑制剂的研发、科学高效的围手术期管理, 有望进一步延长异种移植物的存活率, 并进一步降低感染风险。异种器官移植走向临床指日可待。
然而, 在开展探索性临床研究之前，还有大量工作要做。特别是实体器官，需要对其有效性和安全性进行更多的基础研究。在主管和监管部门的监督下，一旦这些研究的科学基础建立起来，在国内进行异种器官移植的临床试验也将成为可能。
值得欣慰的是，我国政府大力鼓励科研创新，因此我国异种器官移植的氛围和环境有着欧美国家不可比拟的优势。此外，该领域相关的生物技术公司也在茁壮成长，其成长模式在我国乃至世界本身就是一种创新。在我国政府、筹资机构和投资资本提供财政支助的情况下，其必将为异种器官移植研究和发展作出伟大的贡献。
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