发布时间：2022-03-24所属分类：医学职称论文浏览：1次
摘 要： 摘 要：目的 建立复方丹参片的细胞生物电传感效应模型，以此进行复方丹参片的溶出动力学研究。方法 以实时细胞电子分析技术(real-time cell-based assay，RTCA)为手段，测定复方丹参片的体外溶出度，建立溶出动力学模型，并与紫外分光光度法进行比较验证。结果 CCK-8
摘 要：目的 建立复方丹参片的细胞生物电传感效应模型，以此进行复方丹参片的溶出动力学研究。方法 以实时细胞电子分析技术(real-time cell-based assay，RTCA)为手段，测定复方丹参片的体外溶出度，建立溶出动力学模型，并与紫外分光光度法进行比较验证。结果 CCK-8 实验和 RTCA 实验联合筛选出对复方丹参片有特定依赖性的细胞株，建立基于 RTCA 技术的复方丹参片溶出动力学模型，得到最佳拟合模型 Weibull 模型 ln{ln[1/(1-Q)]}=1.071 4 lnt-3.736 7;建立基于紫外分光光度法的复方丹参片溶出动力学模型，得到最佳拟合模型 Weibull 模型 ln{ln[1/(1-Q)]}=1.080 4 lnt-3.723 4;两者的 Weibull 模型比较，RTCA 拟合的模型效果更佳。结论 RTCA 技术应用于中药复方固体制剂溶出动力学研究，具有可行性，并为中药及中药复方质量评价提供了新思路。
关键词：复方丹参片;体外溶出度;实时细胞电子分析技术;溶出动力学模型;CCK-8 实验;Weibull 模型
中国传统医药学十分重视人体气、血、津液的正常运行，认为血瘀证是由气虚、气滞、火热、寒凝等引起，血停滞不行而血行不畅。祛瘀活血法是治疗血瘀证的基本方法，在古代经典著作《伤寒论》《金匮要略》等中均有活血化瘀法的记载，活血化瘀通过多种活血化瘀药物的综合，具有化瘀行滞的作用，通过平衡气血、调节阴阳与疏通活血等多重作用，帮助患者扶正祛邪，淤血消除，疼痛自然消失[1]。现代临床研究[2-5]显示，活血化瘀中药及其复方在改善血流动力学、抑制血栓形成、降低血压、抑制肿瘤疾病上有显著的临床疗效。随着活血化瘀中药及其复方作用机制不断深入研究，证明活血化瘀类中药对改善临床血瘀证具有积极意义，展现出良好的应用前景。复方丹参片作为最为常用的活血化瘀类中成药之一，由丹参、三七、冰片组成，对冠心病、心绞痛以及气滞血瘀所致的胸痹、胸闷等疾病[6]，有确切且显著的疗效，被广泛应用于临床。复方丹参片由于其药效物质成分较复杂，仍有许多疗效不明的未知成分[7-10]，目前所测的化学指标成分往往与其活血化瘀功效不是直接相关，传统的以单一化学指标成分为中心的质量评价方法已不适用，使其质量评价受到限制，亟需能够体现整体药效的新型质量评价与分析方法的建立。
本实验采用了一种新型的电子分析技术实时细胞电子分析技术(RTCA)。RTCA 是一种基于阻抗的瞬态电池-电感应连续记录系统，通过监测细胞的动态变化过程(包括细胞增殖与分化、凋亡与衰老、黏附等多种细胞生理状态)，转换成电信号细胞指数(cell index，CI)，并形成时间剂量依赖性细胞反应曲线(TCRPs)，间接反映药物对细胞作用(促进或抑制)的强弱，并可据此评价药物的生物活性[11]。本实验将 RTCA 应用于复方丹参片血瘀功能相关的细胞生物活性的检测，尝试筛选出对药物反应灵敏、稳定且有特定浓度依赖性的细胞株，探索其用于质量评价的可能性。
1 材料
1.1 实验动物
健康成年 SD 大鼠，雄性，体质量 200～240 g，购于南京青龙山动物养殖场，动物许可证号 SYXK (苏)2017-0001。
1.2 主要试剂与仪器
CCK-8 溶液(日本同仁化学研究所);青链霉素(Gibco 公司);胎牛血清(FBS，浙江天杭生物科技股份有限公司);磷酸盐缓冲液(PBS，Gibco 公司)、胰蛋白酶溶液(Gibco 公司);水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司，分析纯);RTCA 板(杭州艾森生物有限公司);DMEM 培养基(Corning 公司);复方丹参片(广西药用植物园制药厂，批号 171101-049);大鼠心肌细胞(H9C2 细胞)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC 细胞)购自中国科学院上海细胞库，大鼠胸主动脉平滑肌细胞(RA-VSMC 细胞)来自大鼠原代分离。
RC-3 溶出度测试仪(天津新天光公司); UV-2401 紫外可见分光光度计(日本岛津公司); HH-4 数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司); RTCA 实时无标记细胞分析仪(杭州艾森生物有限公司);Sorvall ST16R 台式高速冷冻离心机、Sorvall ST16R 台式低速离心机(美国 Thermo 公司);3111 型 CO2 培养箱(美国 Thermo 公司);涡旋振荡仪(美国 Bio-Rad 公司);ECLIPSE Ti-S 型倒置显微镜(日本 Nikon 公司);1300 SERIES A2 生物安全柜(美国 Thermo 公司)。
2 方法与结果
2.1 CCK-8 法筛选复方丹参片作用细胞的合适质量浓度
2.1.1 HUVEC 或 H9C2 细胞的培养 将复苏的 HUVEC 或 H9C2 细胞置于饱和湿度的细胞培养箱中，用含 10% FBS 的 DMEM 培养基，在 37 ℃、 5% CO2 条件下培养细胞至 85%融合度时，用 0.25% 胰蛋白酶消化传代，倒置显微镜中观察，取对数生长期的细胞用于细胞实验。
2.1.2 RA-VSMC 细胞的制备及培养 取体质量约 220 g SD 大鼠，ip 10%水合氯醛溶液(35 mL/kg)，待大鼠麻醉后处死，迅速剪开胸腔并剪取大鼠胸主动脉组织，立即放入预冷的含 PBS 的 DMEM 培养基(含 1×105 U/L 青链霉素)，并反复不断洗涤。用手术镊轻轻刮去血管外膜及血管内膜，将血管剪成 1 mm3 左右的小块，分别均匀平铺于培养皿中，向培养皿中加入含 20% FBS 的培养液 3～5 mL，置于 37 ℃、5% CO2 的饱和湿度细胞培养箱中培养，直至传代，取对数生长期的细胞用于细胞实验。
2.1.3 复方丹参片供试样品的制备 取复方丹参片适量，置于研钵内捣碎，取 0.32 g，精密称定，置于 50 mL 量瓶内，加入适量 pH 6.8 的 PBS 溶液，超声 30 min 溶解，再加入 pH 6.8 的 PBS 溶液定容至刻度，滤过不溶物质(辅料的残渣)，4 ℃储存备用。取上述溶液稀释不同倍数配成 0、1.0、1.25、 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、6.4 mg/mL 的药液用于 CCK-8 实验。
2.1.4 细胞种板及给药 取正常培养的处于对数生长期的细胞，1 000 r/min 离心 5 min，计数板下计数，调整细胞密度为 2×104个/mL，铺 96 孔板，每孔均加入 100 μL 细胞悬液，贴壁培养过夜后，加入不同质量浓度(1.0、1.25、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、 6.4 mg/mL)的复方丹参片供试样品，48 h 后每孔加入 10 μL 的 CCK-8 检测液，设置对照孔，37 ℃避光孵育 60 min，在波长 450 nm 测定吸光度(A)值，计算细胞存活率(细胞存活率=A 实验/A 对照)。CCK-8 检测结果见图 1、2，HUVEC 和 H9C2 细胞在复方丹参片 1.0～6.4 mg/mL 反应灵敏，细胞存活率由高降到最低，可作为这 2 种细胞筛选的质量浓度范围，因此选择 0、0.3、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6 mg/mL 这 8 个质量浓度。由图 2 可知，RA-VSMC 细胞在复方丹参片1.0～2.5 mg/mL时细胞存活率一直处于稳定水平，未显示差异，而在复方丹参片 4.0～6.4 mg/mL 时，细胞存活率下降幅度较大。为了更清楚地观察该细胞在复方丹参片不同质量浓度下的作用，需要拉大低质量浓度的间隔，缩小高质量浓度的间隔，因此选择 0、0.5、1、2、4、4.5、5、6 mg/mL 这 8 个质量浓度。
2.2 RTCA 筛选复方丹参片的特定依赖性细胞株
2.2.1 RTCA 实验细胞培养 各细胞培养方法同 “2.1.1”和“2.1.2”项。
2.2.2 复方丹参片 RTCA 实验样品的制备 取复方丹参片适量，置于研钵内捣碎，取 0.32 g，精密称定，置于 50 mL 量瓶内，加入适量 pH 6.8 的 PBS 溶液，超声 30 min 溶解，再加入 pH 6.8 的 PBS 溶液定容至刻度，滤过不溶物质，4 ℃储存备用。取上述溶液稀释不同倍数配成 0.3、0.6、1.0、1.4、1.8、 2.2、2.6 mg/mL 的药液用于 HUVEC 细胞和 H9C2 细胞实验，另取上述溶液稀释不同倍数配成 0.5、 1.0、2.0、4.0、4.5、5.0、6.0 mg/mL 的药液用于 RA-VSMC 细胞实验。
2.2.3 RTCA测定 依据复方丹参片的药理作用[12-14]，本实验选取 HUVEC、H9C2、RA-VSMC 细胞，采用 RTCA 技术，测定 CI 值，测定各个样本的 TCRPs 曲线，通过直观判断和统计分析，考察细胞对药物效应反应的灵敏度、稳定性及浓度梯度依赖性。首先在细胞检测板中每个小孔加入 50 μL 生长介质，再加入密度为 2×104 个/mL 的特定细胞悬液 100 μL。将此细胞检测板在室温下放置 30 min 后，放到培养箱中连续培养。24 h 后，当细胞数量稳定时，取 HUVEC 细胞和 H9C2 细胞的细胞检测板，除对照组外，向每孔中加入配好的复方丹参片供试药液 50 μL，使小孔内的药液终质量浓度分别为 0.3、0.6、 1.0、1.4、1.8、2.2、2.6 mg/mL，每个质量浓度设 3 个复孔。另取 RA-VSMC 细胞的细胞检测板，除对照组外，向每个孔中分别加入终质量浓度 0.5、1.0、 2.0、4.0、4.5、5.0、6.0 mg/mL 的复方丹参片供试样品 50 μL，每个质量浓度设 3 个复孔。将加好样的检测板放入实时细胞电子分析仪中，检测 72 h，测出各药液作用于细胞后所产生的 TCRPs 曲线，筛选出对复方丹参片具有较好浓度依赖性响应的细胞株(即在一定时间内不同质量浓度药物的 TCRPs 曲线明显分开)。结果见图 3 和 4。
由图 3 可以看出，HUVEC 细胞对不同质量浓度的复方丹参片反应较灵敏，给药后 CI 值有明显波动。给药初期，低质量浓度样品组及对照组促进 CI 值的增加，在一段时间后趋向平稳。CI 值在高质量浓度样品组作用下先快速增加，随即大幅度减少， 2.6 mg/mL 样品作用强烈，其 40 h 后 CI 值趋近于 0。给药后期，与对照组相比较，低质量浓度样品组对 CI 值起促进作用，高质量浓度样品组对 CI 值起抑制作用。但是，后期不同质量浓度样品所对应的曲线有重叠现象，难以区分，没有明显的质量浓度梯度依赖性，无法为后期实验做准备。
H9C2 细胞对不同质量浓度的样品反应也较灵敏。给药后 CI 值均出现明显波动。给药初期，低质量浓度样品组及对照组对 CI 值起促进作用，质量浓度越低，促进作用越强，在一段时间后趋向平稳。高质量浓度样品组对 CI 值起抑制作用，且质量浓度越高，其抑制作用越强。整体来看，不同质量浓度所对应的曲线呈现较好的分离，H9C2 对样品也有明显的质量浓度梯度依赖性，可以作为后期实验的细胞。从 CI 值变化来看，有效的质量浓度范围应是 0.3～1.8 mg/mL。
图 4 可见，给药初期，低质量浓度样品组及对照组对 RA-VSMC 细胞 CI 值起促进作用，但幅度较小。高质量浓度样品组对细胞的作用过于强烈，导致 CI 值快速趋于 0，细胞接近凋亡。并且， RA-VSMC 细胞没有明显的质量浓度梯度依赖性。
综上，选择 H9C2 细胞作为复方丹参片溶出度评价的细胞。
2.3 基于 RTCA 的复方丹参片溶出度的测定及动力学模型的建立
2.3.1 溶液的配制 (1)空白人工胃液的配制：按照《中国药典》2015 年版四部，取稀盐酸 16.4 mL，加水约 800 mL 与胃蛋白酶 10 g，摇匀使其充分溶解后，加水稀释定容至 1 000 mL，即为人工胃液。空白人工胃液的配制：除不含胃蛋白酶外，其余与人工胃液配制相同[15]。(2)空白人工肠液的配制：按照《中国药典》2015 年版四部，取磷酸二氢钾 6.8 g，加水 500 mL 使其溶解，用 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 值至 6.8;另外称取 10 g 胰蛋白酶加适量水溶解，将 2 液混合后，加水定容至 1 000 mL，即为人工肠液。空白人工肠液的配制：除不含胰蛋白酶外，其余与人工肠液配制相同[15]。(3)磷酸盐缓冲液(pH 7.4)的配制：按照《中国药典》2015 年版四部，取磷酸二氢钾 1.36 g，加 0.l mol/L 氢氧化钠溶液 79 mL，用水稀释至 200 mL，即得。
2.3.2 复方丹参片溶出度供试样品的制备 (1)不同溶出时间样品：
取空白人工胃液 1 000 mL 置溶出杯中，加热至 37 ℃，调节转篮转速为 100 r/min，将精密称定质量的复方丹参片分别放入转篮内，以空白人工胃液接触药片时为零时刻开始计时，然后按 10、20、30、40、50、60、70 min 定时取样，每次取样 10 mL(立即补充同温同体积的空白人工胃液)，用 pH 7.4 磷酸盐缓冲液调节至 pH 6.8(模拟肠液环境)，取 10 mL 于蒸发皿水浴蒸干，用 3 mL 细胞培养液溶解，微孔滤膜滤过，取续滤液即得。(2)完全溶出样品：另取复方丹参片 10 片，精密称定，计算出平均片质量(W)，将称定的片剂研细，再精密称取相当于 W 的量，置 1 000 mL 量瓶中，加入空白人工胃液至刻度，混匀，置于(37.0±0.5)℃ 水浴中 2 h 以上，每隔 15 min 振摇 1 次。冷至室温，取 10 mL，用 pH 7.4 的磷酸盐缓冲液调节至 pH 6.8，精确测量体积，于蒸发皿水浴蒸干，用 3 mL 细胞培养液溶解，微孔滤膜滤过，取续滤液即得。
2.3.3 CI 测定 将 H9C2 细胞置于含 10% FBS 的 DMEM 培养基中、在 37 ℃下、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。取对数生长期的细胞，800 r/min 离心 5 min，计数板下计数，调整细胞浓度至 2×104 个/mL，RTCA 板每孔中加入 100 μL 细胞悬液，贴壁培养过夜，24 h 后，换液，按照要求加入“2.3.2” 项下的复方丹参片溶出度供试样品溶液 200 μL，继续检测 72 h，得到样品溶液作用于 H9C2 细胞后所产生的 TCRPs 曲线，结果见图 5。
由图 5 可知，溶出时间短的样品对 CI 呈促进趋势，溶出时间长的样品对 CI 呈抑制趋势。加药前 CI 上升，加药后 1～2 h 内 CI 下降较快，2 h 后溶出时间短的样品组 CI 呈稳定上升趋势，溶出时间长的样品 CI 持续下降，说明细胞在给药 1～2 h 内受药物影响最大，且呈现一定的质量浓度梯度依赖性，故选择图 5 所示 24.10～25.85 h 的数据(表 1)进行累积溶出率(Q)计算，并绘制溶出曲线(图 6)。 Q=(CIi-CIck)/(CI0-CIck) CIi 指各时间点溶出样品的 CI 值，CIck 指不加药物时的 CI 值，CI0指药物完全溶出时的 CI 值
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2.3.4 复方丹参片的 CI 溶出动力学模型拟合 为更好地考察复方丹参片的溶出情况，将利用一定的已知数学模型对该溶出过程进行拟合，这也是释药机制研究的常用方法。目前的模型主要有零级模型、一级模型、Weibull 模型、Higuchi 模型、Ritger-Peppas 模型等。其中零级模型考察是否恒速释药，一级模型考察是否非恒速释药。Weibull 模型应用广泛，几乎适用于所有溶出曲线。Higuchi 模型主要用于研究缓释制剂等，Ritger-Peppas 模型主要用于研究圆球型制剂的释放机制。考虑到本实验中复方丹参片的制剂特点，选用零级模型、一级模型及 Weibull 模型进行拟合。结果见表 2。可知，复方丹参片的累积溶出率与时间有很好的相关性，且与上述模型具有较好的拟合度，其中最佳拟合模型为 Weibull 模型。
2.4 紫外分光光度法测定复方丹参片的溶出度及拟合模型的建立
2.4.1 线性关系考察 量取“2.3.2”项下复方丹参片完全溶出溶液适量，用 pH 7.4 的磷酸盐缓冲液调节至 pH 6.8，滤过，将此时的滤液作为 100%溶出量，并用 pH 6.8 的空白人工肠液稀释成相对溶出量为 90%、70%、50%、30%、20%、10%的浓度系列，以 pH 6.8 的人工肠液为空白，测定在 283 nm 条件下的 A 值。以相对溶出量为横坐标(X)，A 值为纵坐标(Y)，计算回归方程[16]，回归方程为 Y=0.021 8 X-0.002 7，r=0.999 4。
2.4.2 稳定性试验 吸取适量相对溶出量为50%的溶液，分别在 0、1、2、4、6、12 h 测定 A 值，结果分别为 0.064、0.065、0.065、0.066、0.064、0.065， RSD 为 1.16%，RSD<3.0%，表明药液稳定性较好。
2.4.3 精密度试验 吸取适量复方丹参片完全溶出的药液，重复 6 次测定 A 值，测得 A 值分别为 0.127、 0.128、0.128、0.127、0.128、0.128，RSD 为 0.4%， RSD<3.0%，表明该仪器精密度良好。
2.4.4 样品溶出度测定 取复方丹参片 10 片，精密称定，计算出平均片质量(W)，将称定的片剂研细，再精密称取相当于 W 的量，置 1 000 mL 量瓶中，加入空白人工胃液至刻度，混匀，置于(37.0±0.5)℃ 水浴中 2 h 以上，每隔 15 min 振摇 1 次。冷至室温，取 10 mL，用 pH 7.4 磷酸盐缓冲液调节至 pH 6.8，取样，微孔滤膜滤过，取续滤液用紫外可见分光光度计于 283 nm 处测定 A 值(A 总)。取空白人工胃液 1 000 mL 置溶出杯中，加热至 37 ℃，调节转篮转速为 100 r/min，将精密称定质量的复方丹参片 1 片(W1)放入转篮内，以空白人工胃液接触药片时为零时刻开始计时，然后按 10、 20、30、40、50、60、70、80 min 定时取样 10 mL (立即补充同温同体积的空白人工胃液)，用 pH 7.4 磷酸盐缓冲液调节至 pH 6.8，取样，微孔滤膜滤过，取续滤液用紫外可见分光光度计于 283 nm 处测定 A 值(Ai)。按公式计算 Q。绘制溶出度曲线(图 7)。 Q=WAi/W1A 总
2.4.5 复方丹参片的紫外分光光度法溶出动力学模型拟合 以零级模型、一级模型、Weibull 模型对溶出过程进行拟合，结果见表 3。复方丹参片的累积溶出率与时间有较好的相关性，与 3 种模型有较好的拟合度，其中与 Weibull 模型的拟合度最佳。——论文作者：马晓斐 1 ，王建春 2 ，潘金火 1, 2，谢 辉 1 ，陈 军 1 ，张 倩 1 ，韩星星 1 ，严国俊 1*
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