发布时间：2022-05-09所属分类：农业论文浏览：1次
摘 要： 摘 要: 从马齿苋植株中分离内生真菌，提取其代谢产物，以黄酮类化合物显色反应和紫外光谱特征对内生真菌代谢产物进行初步鉴定，筛选得到产黄酮内生真菌 AG -10，使用 ITS1、ITS4 通用引物，扩增菌株 AG-10 的 18S rDNA 序列，结合菌落和分生孢子形态特征，对菌株 AG-10
摘 要: 从马齿苋植株中分离内生真菌，提取其代谢产物，以黄酮类化合物显色反应和紫外光谱特征对内生真菌代谢产物进行初步鉴定，筛选得到产黄酮内生真菌 AG -10，使用 ITS1、ITS4 通用引物，扩增菌株 AG-10 的 18S rDNA 序列，结合菌落和分生孢子形态特征，对菌株 AG-10 进行分类鉴定，并采用滤纸片法研究 AG-10 的代谢产物抑菌效果; 菌株 AG-10 鉴定结果为镰刀菌( Fusarium sp.) ，其代谢产物可抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，最小抑菌质量浓度分别为 1. 0 mg /mL 和 2. 0 mg /mL。研究结果证实了马齿苋中存在有可能产黄酮类化合物的内生真菌，为利用微生物产黄酮类化合物提供参考。
关键词: 马齿苋; 内生真菌; 黄酮; 抑菌
0 引 言
植物内生菌( Endophyte) 是指能够生活在植物各组织和器官内，而不引起植物病变的一类微生物，可分为真菌、细菌和放线菌三大类[1]，自 1993 年 A. Stierle 等[2]人从红豆杉中分离得到一株能够产紫杉醇的 Taxomyces andreanae 的真菌后，为植物内生真菌生产天然活性物质提供了理论基础。植物的生长各阶段、药用成分都与内生菌尤其是内生真菌[3]相关，植物内生真菌的主要代谢产物为糖类、苯丙素类、醌类、黄酮类、萜类、甾体和生物碱等类群[4]，其中黄酮类化合物因具有抗 炎、抗菌和抗病毒等作用而受到 普遍关注[5-6]。马齿苋( Portulaca oleracea L.) 为常见草本植物，主要生物活性成分: 黄酮类、生物碱、多糖类、儿茶酚、三萜类，具有抗菌、抗氧化作用、抗病毒等作用[7-10]，目前主要集中在对马齿苋代谢产物的研究，但对产黄酮马齿苋内生真菌代谢产物的研究仍比较少。
本研究从马齿苋中分离出内生真菌，以黄酮类化合物显色反应和紫外光谱特征对内生真菌代谢产物初步鉴定，筛选出产黄酮的内生真菌，扩增其 18S rDNA 序列，并结合菌落和分生孢子的形态特征，对菌株进行鉴定，并采用滤纸片法，测试其代谢产物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用，探究其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌最小抑菌浓度。
1 材料与方法
1.1 材料
试验所用野生马齿苋采自于陕西省延安市枣园镇( N36°37'22. 11″，E109°25'44. 09″) ，用无菌采样袋避光运回实验室，材料需当天开展试验使用。
1.1.1 指示菌株
试验所用金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus) 、大肠杆菌( Escherichia coli) 由延安大学资源与环境微生物实验室提供。
1.1.2 主要仪器
GR110DA 灭 菌 器 ( 厦 门 致 微 仪 器 有 限 公司) ，UV-1780 紫外可见光分光光度计( 日本岛津) ，T960 型 PCR 仪( 力康生物科技有限公司) ， RE-5298 旋转蒸发仪( 上海昕仪仪器仪表有限公司) 。
1.1.3 培养基
马铃薯葡 萄 糖 琼 脂 培 养 基 ( potato dextrose agar，PDA) : 马铃薯 200. 0 g，葡萄糖 20. 0 g，蒸馏水 1 000. 0 mL，pH 自然，121 ℃灭菌 20 min，配制固体培养基时，则需另加入 15. 0～20. 0 g 琼脂粉。
PYG 培养基( peptone yeast glucose broth) : 牛肉膏 3. 0 g，蛋白胨 5. 0 g，酵母膏 0. 2 g，葡萄糖 5. 0 g，NaCl: 0. 5 g，MgSO4·7H2O: 1. 5 g，蒸馏水 1 000. 0 mL，pH 7. 2 ～ 7. 5，121 ℃ 灭菌 20 min，配制固体培养基时，则需另加入 15. 0～20. 0 g 琼脂粉。
水琼 脂 培 养 基: 琼 脂 粉 17. 0 g，蒸 馏 水 1 000. 0 mL，121 ℃灭菌 20 min。
1.2 方法
1.2.1 样品的表面消毒
将采集马齿苋的根和茎用无菌水进行多次冲洗，去除表面尘土，待表面干燥，进行表面消毒处理，茎使用体积分数为 75%乙醇溶液消毒 40 s，然后再使用体积分数为 3% 次氯酸钠溶液消毒 4 min，根使用体积分数为 75%乙醇溶液消毒 30 s、然后再使用体积分数为 3%次氯酸钠溶液消毒 2 min。样品表面消毒完全后，备用。
1.2.2 内生真菌的分离、纯化
用无菌水冲洗消毒完全的茎和根 3 次，最后一次冲洗植物组织的无菌水用移液枪吸取 30. 0 μL移入 PYG、PDA 平板中，用涂布器涂抹均匀，以此作为对照组。将消毒完全的茎和根与灭菌石英砂一起研磨，加入 10. 0 mL 的无菌水制成悬液，依次进行梯度稀释，稀释倍数分别为: 10、102 、103 、 104 、105 、106 ，将稀释好的悬液 30. 0 μL 分别涂布在 PDA 固体培养基上，28 ℃，培养 5 d，每个梯度设置 3 个平行对照，以气生菌丝和营养菌丝的形态、长度和颜色为分类依据，挑取菌丝，转接到新的 PDA 固体培养基上，进行菌种纯化，菌株编号依次为: AG-1、AG-2、AG-3、……AG-n。
1.2.3 内生菌代谢产物提取
将所分 离 纯 化 的 马 齿 苋 内 生 真 菌 接 种 至 PDA 液体培养基进行发酵，28 ℃，160 r/min，发酵7 d，发酵液体积为 2. 0 L，待发酵完毕，四层纱布过滤发酵液，除去菌丝，将滤液 100 ℃ 水浴加热，浓缩至 50. 0 mL，浓缩液先用 50. 0 mL 石油醚除去脂质等杂质，然后再用乙酸乙酯分 3 次萃取浓缩液中马齿苋内生真菌代谢产物，浓缩液与萃取剂的体积比始终保持 1 ∶ 1，合并 3 次萃取剂，65 ℃ 旋转蒸发乙酸乙酯，蒸发至近干后用 20. 0 mL 甲醇溶解固体物质，过 0. 45 μm 有机系滤膜，挥干甲醇备用[11]。
1.2.4 产黄酮内生真菌筛选
参考《天然药物化学( 第 6 版) 》中黄酮类化合物显色反应[12]，对所提取的内生真菌代谢产物进行显色反应，所选择的黄酮类化合物显色反应为: 硝酸铝-亚硝酸钠反应、盐酸锌粉反应、三氯化铁反应、氢氧化钠反应、乙酸镁反应。并对符合黄酮类化合物显色反应的菌株代谢产物进行紫外光谱扫描[13]，紫外光谱用甲醇作为参比溶液，建立基线，检测波长为 200 nm～800 nm，扫描速度为高速，狭缝宽设置为 2. 0，获得光谱。符合黄酮类化合物显色反应和紫外光谱图特征的菌株代谢产物，可认为该菌株能够产黄酮，上述反应中以芦丁为阳性对照，以无菌水为阴性对照。
1.2.5 产黄酮内生真菌鉴定
采用光学显微镜对产黄酮内生真菌进行形态观察，首先，将内生真菌接种在水琼脂培养基上，将无菌盖玻片倾斜插入菌落四周，28 ℃，培养 4 d，待到菌丝生长至盖玻片上时，取出盖玻片，滴加棉兰染液染色在显微镜下观察，产孢结构等特征对照《普通真菌学》、《半知菌分属图册》进行初步形态学分类鉴定[14-15]。
使用 ITS1、ITS4 引物，扩增菌株 18S rDNA 序列进行分子生物学鉴定，总 DNA 提取使用索莱宝公司生产的真菌基因组 DNA 提取试剂盒( Fungi Genomic DNA Extraction Kit) ，扩增 18S rDNA 序列所使用的引物为 ITS1( 5'-CTTCGTCATTAGAGAAGTAA-3') ，ITS4 ( 5-TCCTCCGCTTAGATATGC-3 ) ， PCR( polymerase chain reaction) 反应体系和条件参照康为世纪生产 2×Taq MasterMix( Dye) 所提供的反应体系和条件，94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 40 s，55 ℃ 退火 40 s; 72 ℃ 延伸 50 s，35 个循环， 72 ℃终延伸 10 min，4 ℃低温保存。
PCR 扩增产物用 1%琼脂糖凝胶，90 V 水平电泳 30 min，凝胶成像系统拍照检查扩增结果。扩增产物送至上海生工进行测序，测序结果在 NCBI( national center for biotechnology information) 数据库进行 BLAST 比对，使用软件 MEGA-X 构建系统发育进化树，并将测序结果上传至 GenBank，申请菌株序列登录号。
1.2.6 产黄酮内生真菌代谢产物抑菌活性测定
采用滤纸片法对产黄酮内生真菌代谢产物抑菌活性测试，待测内生真菌代谢产物 1. 0 g，溶于 100. 0 mL 水中，此时质量浓度为 10. 0 mg /mL，并稀释成质量浓度为 0. 5 mg /mL、1 mg /mL、2 mg /mL、5 mg /mL 的溶液备用。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌用无菌水配制成 OD600 = 1. 00 的指示菌菌 悬 液，30 μL 涂 布 在 PYG ( peptone yeast glucose broth) 固体培养基上，将浸润在各个浓度代谢产物溶液中的滤纸片放在涂布过指示菌的 PYG 固体培养基上，28 ℃，培养 4 d，测量抑菌圈直径。每组实验设置 3 个平行对照，以无菌水为空白对照，指示菌为金黄色葡萄球菌，为革兰氏阳性菌，故阳性药物 1 选用青霉素; 大肠杆菌为革兰氏阴性菌，故阳性药物 2 选用头孢唑林钠。选用等浓度的青霉素和头孢唑林钠作为阳性对照。
2 结 果
2.1 产黄酮内生真菌筛选
2.1.1 内生菌代谢产物显色反应
使用 PDA 固体培养基从马齿苋根和茎中分离得到 5 株代谢产物与黄酮显色反应相似的菌株，如表 1 所示。其中菌株 AG-10 和 AG-7 硝酸铝-亚硝酸钠反应为阳性，菌株 AG-10 在所进行的显色试验中均呈阳性，初步鉴定菌株 AG-10 代谢产物为黄酮类化合物。
2.1.2 内生真菌代谢产物紫外光谱检测
黄酮类化合物的甲醇溶液普遍在 200 nm ～ 400 nm 会出现两个峰带，即 300 nm～400 nm 峰带 Ⅰ和 220 nm～280 nm 峰带Ⅱ[12]，以黄酮类代表物质芦丁紫外光谱图为对照，对菌株 AG-10 代谢产物进行紫外光谱分析，结果如图 1 所示，菌株 AG10 在 376. 0 nm 处 有 弱 吸 收 峰，在 269. 0 nm、 219. 0 nm、207. 0 nm 处有 3 个明显的吸收峰，芦丁在 357. 6 nm、256. 6 nm、206. 0 nm 处有 3 个明显吸收峰，芦丁和菌株 AG-10 代谢产物均在 300 nm～400 nm 和 220 nm～280 nm 出现吸收峰，这与黄酮类化合物吸收峰特征相符，结合显色试验反应结果，进一步说明菌株 AG-10 代谢产物中含有黄酮类物质。
2.2 菌株鉴定
AG-10 菌丝前期呈白色，后期呈浅黄色，菌丝稀疏平铺较长，菌落背面为浅黄棕色，菌落中间厚边缘略薄，分生孢子梗细长，分支，孢子镰刀形，无色; 18S rDNA 序列 PCR 扩增产物大小为 550 bp，测序结果在 NCBI 数据库进行 BLAST 比对，结果显示 AG-10 与 Fusarium oxysporum ( JX045827 ) 18S rDNA 序列相似性为 99%，选择 18S rDNA 序列相似性大于 99%的菌株序列，使用 MEGA-X 软件，采用 N-j 法构建系统发育进化树。结合菌株的形态特征和 18S rDNA 序列，初步鉴定 AG-10 为镰 孢 霉 ( Fusarium sp.) ，测序结果上传至 GenBank 申请序列登录号: MK951708。
2.3 内生真菌代谢产物抑菌活性测定
参考抑菌圈实验标准: 抑菌圈直径> 20 mm 属于极敏感，15 ～ 20 mm 属于高敏感，10 ～ 15 mm 属于中敏感，7～ 9 mm 属于低敏感，抑菌圈直径< 7 mm属于不敏感[16]。
AG-10 内生菌代谢产物抑菌活性结果如表 2、表 3 所示，代谢产物抑菌效果随着代谢产物浓度的增加而增加。代谢产物质量浓度为1. 0 mg /mL 时，对金黄色葡萄球菌有抑制作用，但效果不明显，对大肠杆菌无抑菌作用; 代谢产物质量浓度为 2. 0 mg /mL时，对金黄色葡萄球菌有抑菌作用，抑菌圈直径在 4～6 mm 范围内，属于不敏感，对大肠杆菌有抑菌作用，但效果不明显; 代谢产物质量浓度为 5. 0 mg /mL 时，对金黄色葡萄球菌有明显抑菌作用，抑菌圈直径在 10 ～ 13 mm 范围内，属于中敏感，对大肠杆菌有抑菌作用，抑菌圈直径在 7 ～ 9 mm 范围内，属于低敏感; 代谢产物质量浓度为 10. 0 mg /mL 时，对金黄色葡萄球菌有十分明显的抑菌作用，抑菌圈直径在 17～19 mm 范围内，属于高敏感，对大肠杆菌有明显的抑制作用，抑菌圈直径在 12～ 14 mm 范围内，属于中敏感。AG-10 代谢产物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌质量浓度为 1. 0 mg /mL，对大肠杆菌的最小抑菌质量浓度为 2. 0 mg /mL。
3 讨 论
据现有报道，赵庆云等[17]利用 HLPC-UV 技术从银杏中分离、筛选出 7 株产黄酮内生真菌，结合内生真菌菌丝形态和孢子特征，鉴定为匐柄霉、丛梗孢属、交链孢属、镰孢霉属、赤霉属、蜜孢霉、和暗梗单孢霉属。张海龙等[18]通过显色反应、薄层层析( thin layer chromatography，TLC) 、高效液相色谱法( high-performance liquid chromatograhy， HPLC) 从银杏中分离得到两株产黄酮内生真菌，卷枝毛霉和尖镰孢霉。腾艾静等[13]对苣荬菜中黄酮类化合物的抑菌活性进行了研究，结果显示，苣荬菜中黄酮类化合物对金黄色葡萄球菌有明显的抑菌作用，最小抑菌质量浓度为 0. 5 mg /mL。
本研究从马齿苋根内筛选出一株产黄酮内生真菌 AG-10，通过形态学特征，结合 18S rDNA 序列，鉴定为镰孢霉菌。AG-10 代谢产物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有抑菌作用，最小抑菌质量浓度分别为 1. 0 mg /mL 和 2. 0 mg /mL，且抑菌活性与浓度存在一定的量效关系，随浓度增加，抑菌活性也呈正比例关系逐渐增加。AG-10 代谢产物的抑菌活性与等浓度的青霉素与头孢唑林钠相比效果较弱，可能是由于未对 AG-10 代谢产物进行纯化，代谢产物成分较为复杂。下一步可对 AG-10 代谢产物进行分离、纯化，以期获得高纯度的抑菌活性物质。
马齿苋中黄酮的药理学研究已逐渐成为一个研究的热点，有研究表明，马齿苋中的黄酮类化合物具有抗菌消炎、降脂等多种作用，本研究中 AG10 黄酮类代谢产物与马齿苋植源型黄酮类化合物是否具有一定的内在联系，还有待研究。下一步应对 AG-10 菌株进行生理特性研究和菌体内黄酮代谢途径的研究。在初步分离的内生真菌中，AG-4、AG-5、AG-7 和 AG-9 四株菌代谢产物黄酮类显色反应中有一种或几种微弱的阳性反应，有可能是发酵液中黄酮含量较低，代谢产物化学结构过于复杂，从而影响显色反应结果，因此下一步研究应采取高效液相( HPLC) 、质谱( mass spectrometry，MS) 、核 磁 共 振 ( nuclear magnetic resonance，NMR) 等方法[19]，对代谢产物的化学结构进一步分析，将产黄酮类真菌的代谢产物一一分离，得到单体化合物。并通过发酵条件和工艺优化等方法和手段，提高代谢产物的产量，使利用微生物发酵生产黄酮类物质成为可能。
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4 结 论
本研究从马齿苋中分离内生真菌，以黄酮类化合物显色反应和紫外光谱特征对内生真菌代谢产物进行初步鉴定，筛选出产黄酮内生真菌 AG10，经鉴定 AG-10 镰孢霉，其代谢产物可抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，最小抑菌质量浓度分别为 1. 0 mg /mL 和 2. 0 mg /mL。——论文作者：艾加敏，余天飞，李 静，姜影影，柳晓东，邓振山*
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