发布时间：2020-04-17所属分类：农业论文浏览：1次
摘 要： 摘要：采用罗丹明B平板初筛和摇瓶发酵复筛法从含油脂丰富的土样中筛选出产脂肪酶活性较高的菌株，并对活性最高的菌株TZ-1进行16SrDNA鉴定和发酵产酶条件分析，发现TZ-1属约氏不动杆菌(Acinetobacterjohnsonii)，最佳产酶条件为温度30℃、培养基初始pH值为8.0
摘要：采用罗丹明B平板初筛和摇瓶发酵复筛法从含油脂丰富的土样中筛选出产脂肪酶活性较高的菌株，并对活性最高的菌株TZ-1进行16SrDNA鉴定和发酵产酶条件分析，发现TZ-1属约氏不动杆菌(Acinetobacterjohnsonii)，最佳产酶条件为温度30℃、培养基初始pH值为8.0、发酵时间48h，此时酶活性可达22.7U/mL;对TZ-1菌株所产脂肪酶进行酶催化特性分析发现，该脂肪酶属中温碱性脂肪酶，其最适作用温度为50℃，最适作用pH为8.0，60℃下半衰期为3h，70℃下的半衰期约1.5h，pH值8～9时稳定性良好。
关键词：脂肪酶;菌株筛选鉴定;酶学性质;约氏不动杆菌
脂肪酶(Triacylglycerolacylhydrolases，EC是一类可高效催化三酰甘油酯水解的酶类，广泛存在于动物、植物和微生物体内，可以催化酯化、酯交换反应、醇解反应和酸解等反应，具有稳定性好、催化专一性和底物多样性等特点，被广泛应用于油脂化工、食品工业、能源和环境等多种领域的工业生产中[1-2]。因动植物来源的脂肪酶的种类和数量均较少，大规模工业生产应用受限，微生物来源的脂肪酶研发与生产越来越受到国内外研究者和生产厂家的青睐[1-4]。
产脂肪酶的微生物种类很多，目前已发现有65个种属的微生物可以产生脂肪酶[5]，其中细菌28个属、酵母菌10个属、放线菌4个属、其他真菌23个属[6]。因微生物具有种类多、繁殖快、易发生遗传变异等特点，使得微生物产脂肪酶具有作用温度范围广、作用值以及底物专一性更强，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，因而可人工控制大量积累目的酶，适合于进行工业化大生产和获取高纯度样品。早在20世纪60年代，假丝酵母、曲霉、根霉等发酵生产的脂肪酶已相继在日本进入商品化生产应用[7]。我国也在20世纪60年代开始开展脂肪酶的研究开发，并于1969年将解脂假丝酵母(Candidalipolytica)发酵生产的脂肪酶制剂供应市场，但到目前为止，只有解脂假丝酵母和扩展青霉(Penicilliumexpansum)2种菌所产生的脂肪酶实现了工业化生产，与国外尚有一定差距[7-8]。因此筛选开发脂肪酶活力高、产量高、应用成本低的新型脂肪酶产生菌具有重要的研究意义。
从江苏省连云港东海县某饭店附近下水道泥土中取样，通过初筛、复筛等获得一株高产脂肪酶的菌株，对其进行鉴定和产酶条件优化，并对其脂肪酶学性质进行了初步分析，以期为脂肪酶的更广泛应用提供一定的基础。
1材料与方法
1.1材料与仪器
土样：江苏省连云港东海县某饭店下水道;氯化钠、葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、对硝基苯丁酯、对硝基苯酚、乙腈、橄榄油、罗丹明B、聚乙烯醇、其余试剂：分析纯。
超净工作台：上海苏净净化有限公司;恒温培养箱：北京恒诺利兴科技有限公司;恒温培养振荡器：上海南荣实验设备有限公司;冷冻离心机：Eppendorf中国有限公司。
1.2试验方法
1.2.1培养基及相关试剂配制LB培养基(g/L)：酵母浸膏5，胰蛋白胨10，NaCl10;初筛培养基(g/L)：酵母浸膏5，胰蛋白胨10，NaCl10，橄榄油乳化液10，琼脂粉20;复筛培养基：初筛培养基中加入0.001%的罗丹明B;富集培养基(g/L)：酵母浸膏5，胰蛋白胨10，NaCl10，橄榄油乳化液5;发酵培养基(g/L)：酵母浸膏5，胰蛋白胨10，NaCl10，橄榄油乳化液10。
聚乙烯醇溶液：取20g聚乙烯醇，加蒸馏水800mL，加热至全溶，冷却后定容至1L，双层纱布过滤后备用;橄榄油乳化液：按橄榄油与聚乙烯醇溶液以1:3的比例混合后，在300W超声波下乳化5min;PBS缓冲液：称取71.6gNa2HPO4·12H2O溶解后定容至1L(0.2mol/LNa2HPO4)，称取31.2gNaH2PO4·2H2O溶解后定容至1L(0.2mol/LNaH2PO4)，取19mL0.2mol/L的NaH2PO4、81mL0.2mol/L的Na2HPO4混合后即得pH7.4、0.2mol/L的PBS缓冲液。
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1.2.2菌株的初筛称取1g样品溶于10mL带有玻璃珠的无菌水中，震荡充分溶解稀释，无菌条件下取5mL的土壤稀释液加入200mL富集培养液中，180r/min、28℃培养48h。取富集液进行梯度稀释、涂布于初筛培养基上37℃倒置培养48h后，观察平板上水解圈，将有水解圈的菌株进行记录保存。
1.2.3菌株的复筛挑取初筛平板上水解圈较大的20个单菌落分别接种于50mL的发酵培养基中，28℃、180r/min培养48h。用打孔器在含0.001%罗丹明的复筛固体培养基平板上打孔，取1mL发酵液滤膜过滤，将滤液分别打到这些孔中，37℃培养48h，观察荧光圈情况;剩余发酵液4℃、8000r/min离心10min，取上清液用硝基苯丁酸酯法测定脂肪酶活性。挑选有荧光圈且脂肪酶活性最高的菌株进行菌种鉴定、菌株产酶条件分析和脂肪酶催化特性初步分析等试验。
1.2.4菌株鉴定挑取少量待测菌株于20mLLB液体培养基中，28℃、180r/min培养12h。取2μL菌液，用细菌16SrDNA通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)为引物，进行菌落PCR扩增。
PCR反应体系为50μL(μL)：模板2，引物27F2，引物1492R2，10×PCRBuffer5，dNTPMix(2.5mmol/each)4，ddH2O34.5，TaqDNApolymerase(5U/L)0.5。
PCR反应为：94℃预变性5min;94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环;72℃后延伸5min。
1.2.5粗酶液的制备与酶活性测定按照1%的接种量接种到50mL/250mL的发酵培养基中，28℃、180r/min培养48h后，4℃、8000r/min离心10min，上清液即为脂肪酶粗酶液。
将2.78mLPBS缓冲溶液和0.2mL10mmol/L硝基苯丁酸酯组成的反应体系37℃保温15min后加入20μL脂肪酶粗酶液，立即混匀计时60s，加入3mL0.5mol/L的NaOH溶液终止反应后，410nm条件下测定吸光度值[9]。以每分钟产生1μmol对硝基苯酚所需要的酶量定义为1个酶活单位(U)。
1.2.6菌株产酶条件研究
1.2.6.1培养温度对菌株产酶的影响将发酵培养基于20、25、28、30、35℃温度条件下，1%接种量、180r/min培养48h后测定其酶活性。
1.2.6.2培养基初始pH值对菌株产酶的影响将发酵培养基初始pH值分别调为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，1%接种量、28℃、180r/min条件下培养48h后测定其酶活性。
1.2.6.3培养时间对菌株产酶的影响将发酵培养基于1%接种量、28℃、180r/min条件下分别培养12、24、36、48、60h后测定其酶活性。
1.2.7脂肪酶酶学性质分析
1.2.7.1温度对脂肪酶催化和酶蛋白稳定性的影响按照前述脂肪酶活性测定条件，将反应体系分别置于20、30、40、50、60、70、80、90℃水浴锅中反应60s后测定其酶活性。
把粗酶液在30、40、50、60℃和70℃温度条件下分别处理0、1、2、3、4h后测定各自剩余酶活性。
1.2.7.2pH值对脂肪酶催化和酶蛋白稳定性的影响按照前述脂肪酶活性测定条件，将反应体系中缓冲溶液替换为pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的缓冲溶液测定其脂肪酶活性。
将粗酶液在pH值分别为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的缓冲溶液中于37℃水浴处理4h后，测定其剩余酶活性。
2结果与分析
2.1菌株筛选
土样经稀释、富集培养后，根据水解圈的有无和大小，初筛出20株产脂肪酶的菌株。进一步以罗丹明B复筛培养基荧光圈大小和发酵液脂肪酶活力大小为筛选条件，结果如图1和表1所示。由表1可知，3号菌株发酵液脂肪酶活性最高，可达20.1U/mL，重新命名为TZ-1，并选择该菌株进行后续研究。
2.2菌株鉴定
以细菌16SrDNA通用引物27F和1492R为引物对TZ-1菌株进行菌落PCR，电泳检测(图2)后，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将测序序列在NCBI网站上进行BLAST分析，发现TZ-1菌株的16SrDNA与不动杆菌属同源性最高。用MEGA-X软件以Neighbor-Joining法构建系统发育树(图3)，结果表明TZ-1菌株与Acinetobacterjohnsonii(NR_117624.1)和Acinetobacterjohnsonii(MK414979.1)进化亲缘关系最近。综上所述，确定TZ-1为约氏不动杆菌。
2.3菌株产酶条件研究
2.3.1培养温度对TZ-1菌株产脂肪酶的影响温度是影响微生物生长代谢的一个重要因子，它可以同时通过影响生物体内的众多生化反应和外界其他环境因子的变化而影响微生物的新陈代谢，从而影响微生物体内多种生物酶的合成。试验中控制发酵培养温度分别为20、25、28、30、35℃，分别测定其脂肪酶活性，结果如图4所示。适当提高发酵温度有利于TZ-1菌株产生高活性的脂肪酶，其最适产酶温度为30℃，此时脂肪酶活性可达18.4U/mL。
2.3.2培养基初始pH值对TZ-1菌株产酶的影响
将发酵培养基初始pH值分别调为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，发酵后测定其脂肪酶活性，结果如图5所示。由图5可知，TZ-1菌株发酵产脂肪酶的活性随着培养基初始pH值的升高呈现先升高再降低的趋势，在pH值为8.0时，脂肪酶活性最高，可达19.9U/mL。
2.3.3培养时间对菌株产酶的影响将培养时间设定为12、24、36、48、60h，然后测定其发酵液中脂肪酶的活性，结果如图6所示。脂肪酶活性随着发酵时间的延长而不断增加，48h时达到最高值20.1U/mL。
2.3.4验证试验综合上述产酶条件进行验证试验，发酵条件为培养温度30℃、培养基初始pH8.0、接种量2%、培养时间48h，此时TZ-1菌株所产脂肪酶酶活为22.7U/mL，高于试验中其他发酵条件下所产脂肪酶的酶活。
2.4脂肪酶酶学性质分析
2.4.1温度对脂肪酶催化活性和酶蛋白热稳定性的影响在20～90℃温度内，对TZ-1发酵产脂肪酶酶促反应活性受温度的影响状况进行了分析，结果如图7所示。在20～50℃温度内，随着酶促反应温度的升高，目的脂肪酶反应活性逐步增加，50℃时达到最高，为21.8U/mL;之后，随着反应温度的继续升高，高温导致部分蛋白质变性，从而使得目的脂肪酶反应活性迅速降低;至90℃时，目的脂肪酶反应活性低至4.5U/mL。综上所述，TZ-1菌株发酵生产的脂肪酶属于中温脂肪酶。
进一步研究该脂肪酶在各温度下的热稳定性，发现在30、40、50℃的温度下，2h内酶活较为稳定，均可保持初始酶活80%以上，随着时间延长，残余酶活逐渐降低，4h后降为初始酶活的60%～70%;60℃时，脂肪酶热稳定性有较大幅度降低，2h内剩余酶活仅为初始酶活的62%，4h后降为初始酶活的40%，其半衰期约为3h;而在70℃条件下，目的脂肪酶相当不稳定，约1.5h即达到该脂肪酶的半衰期，4h后剩余酶活仅为初始酶活12%(图8)。
2.4.2pH值对脂肪酶催化活性和酶蛋白酸碱稳定性的影响TZ-1产脂肪酶酶促反应最适pH值试验分析发现，随着pH值增加，TZ-1产脂肪酶酶促反应酶活性呈现先增加后降低的趋势，pH值6时脂肪酶活性较小(约9.1U/mL)，pH6～7的斜率明显要低于pH7～8的斜率，说明当反应体系由弱酸性变为弱碱性后，脂肪酶催化活性快速增加，在pH8时活性达到最大值，为20.8U/mL;之后，随着pH值继续增大，酶催化活性逐渐降低，但在pH8～11降低趋势比较缓慢，说明TZ-1菌株所产脂肪酶属于碱性脂肪酶，酸性条件不利于该脂肪酶作用(图9)。
脂肪酶pH值稳定性试验分析发现，TZ-1产脂肪酶在pH6～7的缓冲溶液中处理4h后，酶活性下降较为明显，剩余酶活仅为初始酶活的67%～70%;在pH8～9时，脂肪酶活性较为稳定，剩余酶活均在80%以上;随着处理pH值继续增加，目的脂肪酶活性又有较为明显的下降(图10)。综上所述，TZ-1所产脂肪酶的酶活性在pH8～9范围内稳定性良好。
3讨论
目前，假单胞菌、链霉菌、克雷伯氏菌、伯克霍尔德氏菌、芽孢杆菌和发光杆菌等细菌已见报道被用于脂肪酶生产，近年来关于不动杆菌产脂肪酶的研究报道逐渐增多[10-14]。不动杆菌是严格好氧细菌，普遍存在于土壤中[15]，其所产生的脂肪酶多为中温酶、最适作用温度40～60℃、热稳定性较好、最适作用pH7.0～10.0、耐碱性较好[10,16]。筛选得到的约氏不动杆菌TZ-1所产的脂肪酶最适温度50℃、在30～50℃温度内热稳定性好、最适pH值为8.0、在pH8～9内可较长时间以较高活性稳定存在，符合有关文献报道，且TZ-1菌株所产的脂肪酶在60～70℃仍有较好的热稳定性，表明其在环境治理、洗涤制品等方面具有广阔的应用前景。
SCI SSCI AHCI