发布时间：2021-10-16所属分类：免费文献浏览：1次
摘 要： 基因组学与应用生物学
《蒲公英不同部位提取物抑菌作用研究及口服液研制》论文发表期刊：《基因组学与应用生物学》；发表周期：2021年01期
《蒲公英不同部位提取物抑菌作用研究及口服液研制》论文作者信息：庞纪伟 崔鹏程 冯印 张群 陈叶珍 孙悦 陈海燕 *
摘 要 为检验蒲公英的抗菌活性并制备出口感最佳的蒲公英口服液，试验采用药敏法和最低抑菌浓度值
(minimum inhibitory concentration, MIC)检验蒲公英提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果，并以感官特性和黄酮含量为指标，并通过正交试验统计分析确定口服液的最佳工艺组方。结果表明：同浓度下全 草水提物的抑菌效果要优于根水提物，其提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果优于对大肠杆菌的抑菌效果;通过单因素试验和正交试验得出复配型蒲公英口服液的最佳工艺组方为 A3B3C3，即蒲公英原液 35%、枸杞原液 20%、蜂蜜原液 14%、抗坏血酸 0.3%，羧甲基纤维素钠添加量为 0.02%时口感最佳，此工艺下口服液中 黄酮含量为 3.71 mg/mL。本试验为新型保健食品的开发提供理论依据。
关键词 蒲公英; 抑菌作用; 口服液; 黄酮
Abstract In order to test the antimicrobial activity of dandelion extract and preparation of the function and taste the best of dandelion compound oral liquid, test by using drug susceptibility and minimum inhibitory concentration
(MIC) value dandelion extract on Escherichia coli and Staphylococcus aureus antibacterial effect, on the basis ofsensory evaluation and flavonoids content detection, by orthogonal test, determine the best craft formula of dand elion compound oral liquid. The results showed that the antibacterial effect of the extract of whole grass was better than that ofroot water extract at the same concentration, and the antibacterial effect of the extract on Staphylococcusaureus was better than that of Escherichia coli. Through single factor test and orthogonal test, the optimal formula of compound dandelion oral solution was A,B,C, namely 35% of dandelion original solution, 20% of Lycium barbarum original solution, 14% of honey original solution, 0.3% of Vitamin C, and 0.02% of carboxymethyl cellulose sodium added. Flavonoids content in the oral solution was 3.71 mg/mL. This study provided a theoretical basis for the development of new health foods.
Keywords Dandelion: Bacteriostatic action; Oral solution; Flavonoids
蒲公英为菊科蒲公英属多年生草本植物，又名婆婆丁、蒲公草、黄花地丁等，因其生物活性显著，在中药界被誉为具有清热解毒，抗感染作用的“八大金刚”之一。蒲公英植物体中化学成分丰富，含有蒲公英素、蒲公英醇、有机酸、胆碱、菊糖等(郭希娟等，2016)。
蒲公英味苦、甘，性寒，入肝胃两经，有清热解毒、利尿通淋、消肿散结、健胃消炎、保肝利胆和清热活血的功效(Domitrovic et al，2010;Ovadje et al，2011)，此外还具有抗菌、抗真菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳、降血糖、保肝利胆、保护胃肠、改善血管功能、免疫调节等作用。
目前，世界各国都在研制蒲公英保健品。古法常用蒲公英汁液帖敷缓解肺癌疼痛，治疗流行性疾病，如腮腺炎、砂眼等，是中国民族用药之良方，如藏药，蒙药，彝药等。近年来研究发现，蒲公英全草、根和花，均具有独特的药理功效，因而成为开发绿色天然植物型营养保健品的理想资源，但由于自身的苦涩口感而限制了其在食品领域的应用。因此，开发一款具有良好适口性兼具药性的药食同源口服液将会有巨大的市场发展潜力(王艳萍等，2016)
本试验测定了蒲公英提取物的抑菌活性，研究了复配蒲公英口服液的工艺组方，并进行了功能性成分黄酮的含量测定，以期为中国新型保健食品的开发提供理论依据。
1结果与分析
1.1 蒲公英提取物药敏试验
为了确认受试菌种的纯度，受试菌种经革兰氏染色后，在显微镜下观察菌体形态，发现金黄色葡萄球菌呈球形，排列成葡萄串状，大肠杆菌呈短小杆状 (图 1)。形态学观察结果表明供试菌种无杂菌污染， 符合试验要求。 采用二倍稀释法将蒲公英提取物梯度稀释，通过药敏纸片法来测定全草和根提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性，3 次平行试验取平均值。根据试验结果可知，蒲公英全草和根的提取物对两种菌都产生了明显的抗菌作用，全草提取物的抗菌效果优于根的抗菌效果(表1)，金黄色葡萄球菌的平均抑菌环直径大于大肠杆菌，说明蒲公英提取物对金黄色葡萄球菌的抗菌效果相对于大肠杆菌来说更为明显。
1.2蒲公英提取物MIC值测定试验采用蒲公英全草和根水提物分别对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最低抗菌浓度("+"为阴性不抑制，“一”为阳性抑制进行测定。全草水提物对大肠杆菌的最小抑菌浓度为80 mg/mL，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为72 mg/mL：根水提物对大肠杆菌最小抑菌浓度分别为 108 mg/mL，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为 84 mg/mL;即同浓度下全草 水提物的抑菌效果要优于根水提物(表 2)。
1.3 单因素试验分析
以枸杞原液添加量、蜂蜜原液添加量、维生素 C 添加量为 3 个因素研究其对口感检测的影响。枸杞原液添加量在 16%~20%时评分呈上升趋势，添加量 在 20%以上时，口感随之降低，感官评价分数随之小 幅度降低(表 3)。因此，枸杞原液添加量为 20%时是最佳添加量。而蜂蜜添加量在 12%以下时口感评分随 之增加，添加量在 12%以上时评分逐渐下降(表 4)。 因此，蜂蜜添加量在 12%时为最佳添加量。维生素 C 添加量在 0.2%以下时口感评分逐渐增加，添加量在0.2%以上时评分逐渐下降(表 5)。因此，维生素 C 添 加量在 0.2%时为最佳添加量。
1.4 正交试验分析
通过单因素试验，选取 3 因素 3 水平进行正交 试验，得到蒲公英口服液的最佳配比工艺。根据正交 试验结果可知，各因素对口服液口感影响的主次关系为 A>C>B，即对口感影响最明显的是枸杞，其次为维 生素 C，蜂蜜的影响较弱(表 6);得出的优方案为 A3B3C3，即枸杞原液 20%、蜂蜜原液 14%、维生素 C0.3%，但与正交试验方案中得分最高的 9 号方案A3B3C2
不相同，需要进行验证试验。
1.5 蒲公英口服液黄酮含量测定
在 510 nm 处测定吸光度，以芦丁含量(mg)为横 坐标，吸光度为纵坐标，绘制芦丁标准曲线，得线性 回归方程 y=1.13x-0.002 7，R2=0.997 5 (图 2)。 在 510 nm 处测定正交试验 9 组方案的吸光度值，测量 3 次取平均值。并将测得的吸光度值代入线性回归方程 y=1.13x-0.002 7，得到黄酮含量，其中 9 号方案黄酮含量最多，为 3.68 mg/mL，需与正交试验 优方案 A3B3C3 进行验证试验(表 7)。
1.6 验证试验
正交试验方案中 9 号方案 A3B3C2 与优方案 A3B3C3 不相同，需进行验证试验。通过感官评分和黄 铜含量测定，得出最优方案，方案 A3B3C3 的感官评分与黄酮含量均优于 A3B3C2 (表 8)，即复配蒲公英口服 液的最佳工艺组方为蒲公英原液 35%、枸杞原液20%、蜂蜜原液 14%、维生素 C 0.3%，羧甲基纤维素 钠添加量为 0.02%。
2 讨论
高飞雄等(2019)探究了蒲公英植酸对沙门氏菌 的抑菌作用及其抑菌机理。通过分析沙门氏菌的细胞通透性和生长动力学，并结合扫描电镜和荧光显微镜研究其抑菌机理，表明蒲公英植酸是通过破坏细胞膜达到抑菌的效果，其最小抑菌浓度为 2 mg/mL， 并且植酸浓度越高，抑菌效果越显著。谷肄静和王立娟(2007)硏究了蒲公英总黄酮的提取条件及其抑菌性能，考察了乙醇质量分数、料液比、提取温度、提取 时间和提取次数等因素对蒲公英总黄酮提取效果的影响，并在单因素试验基础上进行了正交实验以确定最佳的提取条件。结果表明，0.43 g/L 的蒲公英总 黄酮对宛式拟青霉和枯草杆菌具有良好的抑菌作 用，对酿酒酵母具有一定的抑菌作用，而对黑曲霉没有抑菌作用。本试验在前人研究基础上通过药敏试验和MIC 值检测对蒲公英全草水提物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行抑菌试验，结果表明蒲公英全草水提物对大肠杆菌的最大抑菌直径为 8.30 mm，对金黄色葡 萄球菌的最大抑菌直径为 7.90 mm;全草水提物对大肠杆菌的最小抑菌浓度为 80 mg/mL，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为 72 mg/mL;根水提物对大肠 杆菌的最大抑菌直径为 8.70 mm，对金黄色葡萄球菌 的最大抑菌直径为 8.10 mm;根水提物对大肠杆菌最 小抑菌浓度分别为 108 mg/mL，对金黄色葡萄球菌的 最小抑菌浓度为 84 mg/mL。说明同浓度下全草水提物 的抑菌效果要优于根水提物，且提取物对金黄色葡 萄球菌的抑菌效果优于对大肠杆菌的抑菌效果。
通过单因素试验和正交试验得出复配型蒲公英 口服液的最佳工艺组方为 A3B3C3，即蒲公英原液35%、枸杞原液 20%、蜂蜜原液 14%、维生素 C 0.3%， 羧甲基纤维素钠添加量为 0.02%时口感最佳，此工艺 条件下得到的蒲公英口服液含有黄酮 3.71 mg/mL。
本研究通过大量试验证明了蒲公英水提物具有良好的抑菌效果，并且研究出复配型蒲公英口服液最 佳组方，为后期新型保健食品的开发提供理论依据。
3 材料与方法
3.1 试验材料与试剂
野生蒲公英，采于吉林省长春市净月区郊外;枸 杞、蜂蜜，购于长春市内超市;大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌种，购于通派生物科技有限公司。
芦丁标准品，购自贵州迪大科技有限责任公司：牛肉膏、胰蛋白胨，购自北京奥博星生物科技有限责任公司：琼脂粉，购自北京梦怡美生物科技有限公司：氢氧化钠、氯化钠、羧甲基纤维素钠、亚硝酸钠、硝酸铝，购自天津市光复科技发展有限公司;乙醇，购自天津市富字精细化工有限公司。
3.2仪器与设备
生化培养箱(型号SPX-100B-Z)、电热鼓风干燥箱
(型号GZX-9140MBE)、电热恒温水浴锅(型号HHS-
21-6)，购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂;循环水式多用真空泵(型号SHZ-D(I1)，上海科升仪器有限公司：紫外可见分光光度计(型号UVmini-1280)，岛津仪器(苏州)有限公司。
3.3蒲公英提取物的制备
蒲公英干燥至恒重，分别称取全草和根各20g，纱布包裹，煎煮并浸泡于蒸馏水中6h，过滤，重复3次合并滤液，浓缩至20 mL，通过计算得浓度为500 mg/mlL的全草水提物和根水提物，备用(孙长霞等，2012)
3.4药敏试验
将直径5mm的药敏纸片做好，同时以生理盐水纸片作为阴性对照。浸泡在不同梯度浓度的蒲公英提取物中。微量移液器吸取100 uL菌液，均匀涂抹在培养基上，等待不同浓度的药敏纸片干燥，然后将纸片轻轻贴于培养基表面，恒温培养24 h，然后观察并测定抑菌直径的大小。
3.5 MIC的测定
取5个锥形瓶，各加入18 mL培养基，用二倍稀释法将全草水提物和根水提物稀释为浓度62.5.125250、500 mg/mL的溶液，分别取2mL分装在4个锥形瓶内，另1个锥形瓶加入2mL水，混合均匀。灭菌完毕后，倒入平皿中，用微量移液器吸取100 L菌液滴入各个平板中，将菌液均匀涂抹在培养基表面，恒温培养18h，观察结果(Shi et al，2007;2008：许先猛等，2018)。
3.6口服液制备
蒲公英原液制备：取蒲公英全草粉末5g，加水75 mL放于锥形瓶中，加热微沸1.5 h，过滤，滤渣再次进行提取，重复3次后合并滤液，浓缩液体至50 mL(李喜凤等，200;陶亮亮和李鹏，2011)。
枸杞原液制备：准确称取枸杞40g，纱布包裹，加入600 mL水，加热微沸1 h，过滤，重复3次合并滤液，浓缩液体至200 mL蜂蜜原液制备：准确量取蜂蜜10 mL，添加20 mL水，微热搅拌均匀。
口服液的配制：取35 mL蒲公英原液，按一定比例加入枸杞原液、蜂蜜原液、维生素C和羧甲基纤维素钠，混合均匀，进行感官评价，通过单因素试验和正交试验确定口服液配制的最佳工艺组方。
3.7黄酮含量的测定
芦丁标准曲线的绘制：吸取芦丁标准溶液0、
0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL分别加入6个比色管中，加入0.7 mL 5%亚硝酸钠溶液，振荡混匀静置5 min;然后加入0.7 mL 10%的硝酸铝，振荡摇匀并静置5 min，再加入5mL的1.0 mol/L氢氧化钠，用40%的乙醇溶液定容至10 mL，振荡均匀放置30min，空白组为零管，摇匀后，在比色皿中，510nm处测定吸光度。绘制芦丁标准曲线，以芦丁含量(mg)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标。重复做3次试验试验并取平均值。
吸光度的测定：吸取1mL口服液样液，按芦丁标准溶液吸光度测定的步骤加入显色剂，在510nm处测定吸光度值。
3.8单因素设计水平表
以枸杞原液添加量、蜂蜜原液添加量、维生素C添加量为3个因素，每个因素采取3个水平，并以感官评价标准进行L(3)正交试验，对蒲公英口服液的配方进行优化(表9)。
3.9单因素试验
3.9.1枸杞原液添加量对口感的影响
取35 mL蒲公英原液4份，分别添加枸杞原液16%，、18%，20%，22%，添加维生素C0.3%，添加蜂蜜原液12%，羧甲基纤维素钠添加量为0.02%，进行感官评价，确定枸杞原液的最佳添加量。
3.9.2蜂蜜原液添加量对口感的影响
取35 mL蒲公英原液4份，分别添加蜂蜜原液10%，、12%、14%，16%，添加枸杞原液18%，添加维生素C0.3%，羧甲基纤维素钠添加量为0.02%，进行感官评价，确定蜂蜜原液的最佳添加量。
3.9.3维生素C添加量对口感的影响
取35 mL蒲公英原液4份，分别添加维生素C0.1%、0.2%，0.3%0.4%，添加枸杞原液18%，添加蜂蜜原液12%，羧甲基纤维素钠添加量为0.02%，进行感官评价，确定维生素C的最佳添加量。
3.10正交试验
通过单因素试验，每个因素选取3个水平进行正交试验，共有3个因素，不考虑因素间的交互作用，选取正交表L(3)进行试验方案安排。按照正交试验方案进行口服液的配制，样品编号后进行感官评价，由30人独立对样品各项指标进行打分(表10)，互相无影响，确保评价的客观性，取平均值为样品的得分。
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