发布时间：2021-05-11所属分类：医学论文浏览：1次
摘 要： [摘要]目的：通过生物信息学分析鉴定牙周炎牙龈组织中的关键生物标志物和相关免疫细胞浸润，探索牙周炎的发病机制。方法：从GEO数据库下载GSE10334、GSE16134和GSE23586三个数据集，通过limma程序包筛选差异基因，利用STRING和Cytoscape构建蛋白互作(protein
[摘要]目的：通过生物信息学分析鉴定牙周炎牙龈组织中的关键生物标志物和相关免疫细胞浸润，探索牙周炎的发病机制。方法：从GEO数据库下载GSE10334、GSE16134和GSE23586三个数据集，通过“limma”程序包筛选差异基因，利用STRING和Cytoscape构建蛋白互作(protein-proteininteraction，PPI)网络来获取毂基因，利用CIBERSORT算法分析牙周炎和健康对照之间牙龈组织的免疫细胞浸润。结果：共筛选出129个差异表达基因，构建PPI网络后获取10个毂基因，其显著富集于趋化因子和细胞因子活性等多种细胞生理活动，和细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路、趋化因子信号通路、IL-17信号通路。与健康对照组相比，牙周炎牙龈组织中初始B细胞、浆细胞、初始CD4+T细胞、活化的记忆CD4+T细胞、单核细胞，M1巨噬细胞和中性粒细胞的比例更高(P<0.05)。结论：毂基因的功能分析及探究牙周炎和健康牙龈中所浸润的免疫细胞之间的差异可以为研究牙周炎的发生发展机制提供新的见解和思路。
[关键词]牙周炎;生物信息学;分子生物学;免疫浸润;细胞因子
牙周炎是发生在牙周组织的慢性炎症性疾病，其特征在于牙周组织的破坏，主要是牙槽骨吸收和牙龈炎症，会导致患牙松动、移位，最终可致牙齿丧失。这是我国口腔疾病中患病率最高的疾病之一，已成为成人失牙的首要原因[1]，但牙周炎的发生发展机制尚未完全阐明。牙周炎的发生发展过程中，首要的病理变化就是牙龈组织的炎症，随着牙龈炎症的加剧，细胞因子趋化因子大量分泌，免疫细胞广泛浸润于牙龈组织中，从而进一步诱导根方牙槽骨和牙周膜的吸收，导致牙周组织的破坏。因此探究牙龈组织的免疫炎症过程对于阐明牙周炎发生发展及其中的过度炎症反应至关重要。
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生物信息学是结合分子生物学和信息技术的一门新兴交叉学科，基因芯片已被用于高效、大规模地获取生物信息，并且可以广泛收集疾病的表达谱数据。本文利用生物信息学工具分析了GEO数据库中牙周炎牙龈组织和健康对照组的数据，目的是确定牙周炎牙龈组织中关键生物标志物和相关免疫细胞浸润，为探究牙周炎发生发展机制提供参考，并对牙周局部应用的药物研发提供新的思路。
1材料与方法
1.1数据收集从GEO数据库中下载GSE10334[2]、GSE16134[3]和GSE23586[4]3个数据集(GPL570，AffymetrixHumanGenomeU133Plus2.0Array)。GSE10334包含247个样本(健康牙龈64例，炎性牙龈183例)，GSE16134包含310个样本(健康牙龈69例，炎性牙龈241例)，GSE23586包含6个样本(健康及炎性牙龈各3例)。运用R软件(版本4.0.1)来进行数据分析，其中利用“sva”包[5]对GSE10334、GSE16134和GSE23586数据集进行合并及批次矫正。
1.2筛选差异基因利用“limma”包[6]对GSE10334、GSE16134和GSE23586数据集进行分析，以矫正后P<0.05，|logFC|>1为筛选标准选择差异表达基因，并利用“pheatmap”包[7]绘制差异表达基因的热图。
1.3差异基因的基因本体(GeneOntology，GO)功能富集和京都基因与基因组百科全书(KyotoEncy-clopediaofGenesandGenomes，KEGG)通路富集分析利用R软件中的“clusterProfiler”包[8]对差异基因进行GO和KEGG通路分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
1.4PPI网络构建及毂基因分析利用STRING线上数据库[9]进行差异基因的蛋白互作分析(置信度为0.7)，并利用Cytoscape软件(版本3.8.0)中的Cytohubba插件[10，11]对PPI网络进行相关分析筛选，以最大中心度(maximalcliquecentrality，MCC)[12]前十位的基因为毂基因，同时进行毂基因的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。
1.5利用CIBERSORT进行免疫浸润分析用CIBERSORT算法[13]分析之前获得的标准化基因表达数据，得到22种免疫细胞的比例。计算样品中每种免疫细胞的百分比并进行主成分分析(PCA)，并使用R软件的“vioplot”包[14]比较了两组间每种免疫细胞的浸润水平。
2结果
2.1差异基因的筛选批次矫正并标准化了GSE10334、GSE16134和GSE23586数据集后共筛选出129个差异基因，其中103个基因表达上调，26个基因表达下调，并利用火山图(图1a)和热图(图1b)来展示上调和下调的差异基因。
2.2差异基因的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析GO功能富集分析表明差异基因主要富集于G蛋白耦联受体结合、细胞因子受体结合、细胞因子活性、趋化因子活性等功能(图2a)。KEGG通路富集分析表明差异基因主要富集于细胞因子-细胞因子受体互作、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体相互作用、风湿性关节炎、IL-17信号通路等通路(图2b)。
2.3PPI网络构建和毂基因分析利用STRING和Cytoscape构建PPI网络(图3a)，运用Cytohub-ba插件筛选其中的毂基因(图3b)。GO功能富集分析表明毂基因主要富集于G蛋白耦联受体结合、受体配体活性、信号转导受体激活剂、细胞因子活性等功能(图4a，表1)。KEGG通路富集分析表明毂基因主要富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路、风湿性关节炎等通路(图4b，表2)。
2.4免疫浸润分析牙周炎牙龈组织与健康对照之间的免疫细胞浸润显示出明显的群体间差异(图5a)。与健康对照相比，牙周炎牙龈组织通常包含较高比例的初始B细胞、浆细胞、初始CD4+T细胞、活化记忆CD4+T细胞、γδT细胞、单核细胞、M1型巨噬细胞和中性粒细胞，而记忆B细胞、CD8+T细胞、滤泡辅助性T细胞(Tfh)、调节性T细胞(Treg)、活化NK细胞、M2型巨噬细胞、静息和活化的树突状细胞和静息肥大细胞的比例较低(P<0.05，图5b)
3讨论
牙周炎的病理机制复杂，尚未完全阐明，其中一个重要的病理变化就是牙龈组织的炎症反应，其伴随了牙周炎的整个病程。免疫细胞受到龈下菌斑的刺激而在牙龈结缔组织中广泛浸润并分泌大量促炎细胞因子，这些细胞因子一方面活化免疫细胞抵御细菌侵袭，另一方面也会导致自身牙周组织的破坏[15]。在本研究中，通过比较牙周炎牙龈组织和健康对照之间基因表达谱的差异，来确定牙周炎相关的靶基因。本文通过生物信息学分析筛选出了10个毂基因，并分析了其生物学功能和相关信号通路，发现这些毂基因主要富集在免疫炎症反应和免疫细胞趋化等生物功能和通路上，因此我们用CIBERSORT算法分析了牙龈组织的免疫细胞浸润，结果表明牙周炎牙龈组织和健康对照之间的免疫细胞浸润存在显著差异。
本文获得了10个毂基因，分别是CXCL8、CXCL1、CXCL12、C3、PPBP、PNOC、CXCL6、CXCL13、CXCR4和IL-1β，其中CXCL8在MCC中得分最高。CXCL8又称为IL-8，可以通过CXCL8-CCR1/2通路诱导中性粒细胞趋化到炎症部位并促进其产生超氧阴离子从而发生呼吸爆发，导致机体组织的降解和破坏[16]。牙周炎患者的炎性牙龈组织CXCL8表达上调，龈沟液和血浆CXCL8浓度升高，与探诊深度呈正相关。有体外实验研究发现在炎症情况下，牙龈上皮细胞、牙龈成纤维细胞和牙周膜细胞均能上调表达IL-8，从而参与牙周炎的发生发展。GO分析显示该蛋白参与细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体配体活性和趋化因子活性等病理生理功能。KEGG分析显示，IL-8在风湿性关节炎、细胞因子-细胞因子受体相互作用和NF-κB信号通路中可能起重要作用。以上结果表明该基因在牙周炎的发生发展过程中起关键作用，因此可用作牙周炎的生物标志物和相关治疗靶点。
本研究还发现除CXCL8以外的其他毂基因也主要富集于细胞因子活性和趋化因子活性等免疫炎症功能及相关通路，这说明免疫细胞浸润在牙周炎的整个病程期间中发挥了重要作用。本研究利用生物信息学技术发现趋化因子及其相关受体(如CXCL8、CXCL1、CXCR4、CXCL12、PPBP、CXCL6、CXCL13)在牙周炎组织中均上调表达。通过免疫浸润分析，发现牙周炎牙龈组织包含较高比例的初始B细胞、浆细胞、初始CD4+T细胞、活化记忆CD4+T细胞、γδT细胞、单核细胞、M1型巨噬细胞和中性粒细胞，而记忆B细胞、CD8+T细胞、Tfh、Treg、活化NK细胞、M2型巨噬细胞，静息和活化的树突状细胞和静息肥大细胞的比例较低，与既往研究相比具有很高的一致性。牙周炎中CD4+T细胞的比例显著增加，并且这种细胞优先上调IL-17的表达而非IFN-γ。γδT细胞是上皮组织中的主要T细胞群体，在进行上皮屏障监测和保持组织稳态以及在上皮修复方面具有重要意义，γδT细胞会由于细菌侵袭所致上皮屏障的破坏而大量聚集，抑制γδT细胞会加剧牙龈炎症并改变龈下微生物多样性[17]。B细胞在炎性牙龈组织的大量浸润表明牙周炎正处于进展期。有研究表明，牙周炎病变包含大量的免疫球蛋白、淋巴细胞和浆细胞，表明牙周病变的临床进展是免疫细胞浸润从主要是免疫球蛋白阴性的淋巴细胞变为表达IgG和IgM的淋巴细胞和浆细胞。与之相反的是，牙周炎病变中记忆B细胞的密度显著低于健康牙龈组织，记忆B细胞主要定位在健康牙龈结合上皮根方的结缔组织中，这可能是为了应对菌斑生物膜的刺激而产生的低烈度炎症反应，对于避免相对健康的牙周组织发生亚临床炎症从而导致牙槽骨丧失至关重要[18]。CD8+T细胞具有调节/抑制特性，可以产生IL-10和TGF-β，下调炎症反应并抑制破骨细胞生成，从而维持牙周组织结构完整，避免牙槽骨丧失[19]。Treg细胞对于维持健康牙周组织的稳态至关重要，并可能与一些患者的牙龈炎病变不继续进展有着密切联系，提示Treg细胞和CD8+T细胞在牙周炎发生发展中起到了重要作用[20]。NK细胞可以抑制菌斑微生物对健康牙龈的侵袭，但NK细胞的过度活化会导致组织损伤和牙槽骨吸收。有学者证明在实验性牙龈炎和慢性牙周炎中NK细胞数量增加，但也有发现与之相反[21]，因此NK细胞在牙周炎发生发展过程中的具体作用还需进一步研究。随着牙周炎受到控制，牙龈组织中的M1巨噬细胞会转换成M2巨噬细胞从而抑制炎症反应并促进组织修复，这与本结果一致。本研究还发现树突状细胞的比例在健康牙龈中显著上调，因为它是免疫耐受和保护的关键调节者，当树突状细胞介导的免疫稳态被破坏时，就会引起多种炎症性疾病的发生。因此，健康牙龈稳态的维持需要树突状细胞的参与。曾有研究证明肥大细胞有助于牙龈健康的维持，与本文结果一致，说明这种细胞是维持牙龈健康所必须的[22]，但具体的机制还需要进一步探究。——论文作者：王子恢郜洪宇*莫菲菲田广杰王永兰*
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