发布时间：2020-04-23所属分类：农业论文浏览：1次
摘 要： 摘要：本实验以一株生香酵母异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)作为研究对象，对其菌剂制备进行了研究。结果表明该酵母的适宜离心条件为转速4000r/min时间5min，此时酵母存活率达到86.21%;保护剂的最佳配比为5%海藻糖∶9%乳糖∶9%蔗糖=3∶5∶4;菌泥
摘要：本实验以一株生香酵母异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)作为研究对象，对其菌剂制备进行了研究。结果表明该酵母的适宜离心条件为转速4000r/min时间5min，此时酵母存活率达到86.21%;保护剂的最佳配比为5%海藻糖∶9%乳糖∶9%蔗糖=3∶5∶4;菌泥与保护剂体积比为1∶2时，异常威克汉姆酵母菌的冻干存活率为85.17%。
关键词：异常威克汉姆酵母;冷冻干燥;正交实验;保护剂
生香酵母是一类在发酵过程中能产生使人愉悦香味物质的酵母菌的统称。其在发酵过程中能够合成多种物质如酯、醇、酸和醛等产物，由于其产生的香味物质种类繁多，在传统发酵食品如白酒、葡萄酒、酱油、酱类等生产中接入纯种生香酵母进行发酵的技术已应用多年[1-2]。
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目前企业普遍采用的是菌种逐级扩大培养后再添加的方式，存在菌种退化、污染的可能，而活性酵母菌剂的应用可以有效避免以上问题[3]，同时，活性酵母菌剂有常温下长期贮存而不失去活性、复活后稳定性高的特点[4]，有利于中小发酵食品企业产品品质的稳定和提升。
目前，酵母菌的干燥受到菌种、培养条件、干燥方式、保护剂等多因素的影响，不同菌种间存在明显不同，目前，国内主要对酿酒酵母、鲁氏酵母等主流生产酵母进行了菌剂制备研究，对异常威克汉姆酵母在菌剂制备方面的研究较少。因此本实验针异常威克汉姆酵母菌剂制备进行研究，运用单因素试验，对酵母的保护剂进行筛选，同时对效果比较好的保护剂进行组合优化，希望能达到更好的保护效果，为异常威克汉姆酵母的菌剂提供参考。
1材料与方法
1.1材料与设备
异常威克汉姆酵母2.1329由四川省微生物资源平台菌种保藏中心分离、鉴定、保藏。
YPD基础培养基：葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨2%，琼脂粉2%，121℃灭菌20min。
葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、琼脂粉、海藻糖、蔗糖、乳糖、脱脂乳粉、麦芽糖、葡萄糖、谷氨酸钠。SC-3614低速离心机安徽中科中佳科学仪器有限公;HZQ-X100恒温震荡培养箱太仓市实验设备厂;SPX-250-Z生化培养箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂;Edwards1739真空冷冻干燥器Ed⁃wardsHighVacuum(PartofB.O.CLtd.)Crawley.England。
1.2实验方法
1.2.1生长曲线测定
挑取一环酵母纯培养物接种于100mLYPD液体培养基中，28℃、150r/min震荡培养15h，得活化种子液。
将酵母种子培养液以3%的接种量接入多瓶150mLYPD培养基中，28℃、150r/min震荡培养，培养时间达到3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h时取样品稀释后，通过平板计数法进行活菌数计数，每个时间点做两次平行。以培养时间为横坐标，菌落数为纵坐标绘制菌株在该条件下的生长曲线。
1.2.2离心条件研究
不同的离心条件，对菌体的收集和活性有明显影响，通过研究不同离心转数和离心时间对酵母离心存活率的影响，寻求适宜的离心条件。将酵母发酵菌液分别以转速3500、4000、4500、5000r/min、离心时间3、5、10、15min设定参数进行离心，取离心前菌液及离心后菌泥测定活菌数，计算离心存活率，确定适宜离心条件。
离心存活率(%)=沉降细胞活菌数(CFU/mL)/初始活菌数(CFU/mL)×100%[5]
1.2.3保护剂筛选
保护剂的加入可减轻冷冻和干燥两个过程对菌体的损害，尽可能保持原有的各种生理生化特征和生物活性，提高冻干存活率，选取葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、脱脂奶粉、谷氨酸钠作为冻干保护剂[6-8]，保护剂浓度设定为3%、5%、7%、9%。
将离心后得到的菌泥倒于灭菌的培养皿中，菌泥与保护剂按体积比1∶2混匀，制成菌悬液，用保鲜膜封好立即放入-30℃冰箱进行预冻，预冻时间为2h，预先开启冷冻干燥机，待冷阱温度降至-60℃，迅速将预冻好的菌体放进物料盘内，保鲜膜表面扎孔，关闭舱门开启真空泵，真空冷冻干燥24h。通过平板计数法分别测定冻干前后的活菌数并计算存活率，确定最佳保护剂。
冻干存活率(%)=冻干后活菌数(CFU/mL)/冻干前活菌数(CFU/mL)×100%
1.2.4保护剂添加量实验
以筛选后的保护剂为基础，研究菌泥与保护剂添加比例对存活率的影响，将离心后得到的菌泥倒于灭菌的培养皿中，菌泥与保护剂按(1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3)比例添加后混匀，制成菌悬液。冻干方法参照1.2.3保护剂配方优化实验，测定冻干前后活菌数，计算存活率。
1.2.5复配保护剂优化及验证
根据保护剂筛选试验结果，以三种保护剂作为因素研究最佳复配比例，选用L(934)表进行3因素3水平正交试验[9]。以优化后的离心条件及保护剂进行酵母冻干菌剂制备，验证实验结果。
2结果与分析讨论
2.1酵母生长曲线测定
通过对酵母生长至3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h这几个时间点的活菌数测定，结果见图1，由图1可知，在接入菌种后的0-3h阶段酵母处于迟滞期，3-9h酵母处于对数期，9h后活菌数趋于稳定，达到稳定期，考虑到菌体活性及特性，因此选择12h作为发酵结束进行菌体收集时间点。
2.2离心条件研究
从图2酵母在不同离心转速及时间下的离心存活率折线图可以看出，离心时的转数和时间对菌体存活率有明显影响，相同转数条件下，酵母存活率随离心时间的延长而提高，在离心时间达到5min后，酵母存活率随离心时间的延长开始降低。在离心条件为转速4000r/min离心时间5min时，测得最大酵母存活率为86.21%。
2.3保护剂筛选及浓度实验
本实验选取葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、脱脂奶粉、谷氨酸钠作为冻干保护剂，考察保护剂种类和浓度对酵母菌冻干存活率的影响，结果见表2。
由表2可知，每种保护剂对菌体的冷冻干燥都有保护作用，其中蔗糖、海藻糖、乳糖做保护剂酵母的存活率相对更高。蔗糖浓度9%时酵母冻干存活率最高为76.59%，乳糖浓度9%时酵母冻干存活率最高为59.62%，海藻糖浓度5%时酵母冻干存活率最高为69.39%。因此，选择蔗糖、乳糖和海藻糖三种保护剂做下一步实验。
2.4保护剂添加量实验
以蔗糖、海藻糖和乳糖三种保护剂为基础，研究菌泥与保护剂比例对冻干存活率的影响，实验结果见表3和图3。
从表3和图3可知，不同的保护剂以不同的比例添加酵母冻干存活率纯在较大差异，5%海藻糖作为保护剂随添加量的增加，酵母冻干存活率先升高后降低，在菌体∶保护剂=1∶2时，酵母冻干存活率最高达到67.77%;9%乳糖作为保护剂随添加量的增加，酵母冻干存活率先升高后降低，在菌体∶保护剂=1∶2时，酵母冻干存活率最高达到81.31%;9%蔗糖作为保护剂随着添加量的增加，冻干存活率先升高后降低，随后再次升高，呈N字形趋势，在菌体∶保护剂=1∶1.5时，酵母冻干存活率最高达到82.18%。
2.5保护剂复配优化
根据前面保护剂筛选试验结果，以蔗糖、海藻糖、乳糖三种保护剂作为因素研究最佳复配比例，选用L(934)表进行3因素3水平正交试验，试验结果及极差分析见表4。
由正交试验表4可看出，影响菌株冻干存活率的顺序为：C>A>B，最优冻干保护剂组合为C3A1B3，此时，复配保护剂的比例为5%海藻糖∶9%乳糖∶9%蔗糖=3∶5∶4，菌泥∶复配保护剂=1∶2。以优化后的最优组合进行多次酵母冷冻干燥，最后测得平均冻干存活率为85.17%，基本符合优化条件。
3结论
通过一系列实验表明，异常威克汉姆酵母菌株2.1329在离心转速为4000r/min离心时间5min时，最大酵母存活率达到86.21%。以5%海藻糖、9%乳糖和9%蔗糖采用3∶5∶4的比例复配的保护剂是该菌的最佳保护剂，同时，采用体积比菌泥∶复配保护剂=1∶2时，异常威克汉姆酵母菌的冻干存活率达到85.17%。
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